白木香内生真菌多节孢Nodulisporiumsp_A4的化学成分研究

1、白木香内生真菌多节孢 Nodulisporium sp.A4的化学成分研究李冬利 1, 吴正超 1, 2, 陈玉婵 1, 陶美华 , 章卫民1*(1. 广东省微生物研究所 广东省菌种保藏与应用重点实验室 广东省微生物应用新技术 公共实验室 广东省华南应用微生物重点实验室 -省部共建国家重点实验室培育基地 ,广东 广州 510070; 2. 中国科学院 南海海洋研究所 , 广东 广州 510301摘要 目的 :研究来源于药用植物白木香 、 具有抗肿瘤活性的内生真菌多节孢 Nodulisporium sp. A4的化学成分 。 方 法 :采用马铃薯葡萄糖 (PD 液体培养基培养 、 乙酸乙酯萃取得

2、到内生真菌 A4的发酵液和菌丝体粗提物 , 采用正相硅胶柱色 谱 、反相硅胶柱色谱 、 葡聚糖凝胶 Sephadex LH-20柱色谱 、 制备薄层色谱和重结晶等方法对粗提物进行分离纯化 , 运用现代波 谱技术 (NMR ,MS 结合文献对照鉴定化合物结构 。 采用 MTT 法测定化合物的体外抗肿瘤活性 。 结果 :从内生真菌 A4的发 酵液中分离获得 7个化合物 , 分别为 5-methyl-2-vinyltetrahydrofuran-3-ol (1 , 6-methyl-2-(5-methyl-5-vinyltetrahydrofuran-2-yl hept-5-en-2-ol (2 ,

3、 6-hydroxycyclonerolidol (3 , rel-(1S , 4S , 5R , 7R , 10R -10-desmethyl-1-methyl-11-eudesmene (4 , 酪醇 (5 , 8-甲 氧基 -1-萘酚 (6 , 1, 8-二甲氧基萘 (7 。 从内生真菌 A4的菌丝体中分离获得 3个化合物 , 分别为麦角甾醇 (8 , 过氧化麦角甾 醇 (9 , 啤酒甾醇 (10 。 药理活性评价结果表明在作用浓度为 100mg ·L 1时 , 化合物 3和 4对肿瘤细胞 SF-268和 NCI-H460的抑制率分别为 89. 1%, 44. 2%和 82.

4、3%, 79. 8%。 结论 :化合物 1为新的天然产物 , 化合物 2, 3, 7, 10为首次从该属真菌 中分离得到 , 化合物 3和 4对肿瘤细胞 SF-268和 NCI-H460的增殖具有一定的抑制作用 。 关键词 内生真菌 ; 化学成分 ; 白木香 ; 多节孢稿件编号 20110411004基金项目 国家自然科学基金项目 (20902014 ; 广东省自然科学 基 金 项 目 (9451007002003074 ; 广 州 市 科 技 计 划 项 目 (09B34061446 ; 广东省科学院优秀青年科技人才基金项目 通信作者 *章卫民 ,Tel :(020 37656321, E-

5、mail :wmzhang58yahoo. com. cn植物内生真菌能产生结构丰富多样的次级代谢产物 , 这些代谢产物的结构有些与宿主的某些代谢产 物相同或相似 , 有些是具有潜在药用价值的其他次生 代谢产物 , 并且容易从中发现新颖结构的化合物 , 它 们已成为发现新天然活性物质的重要资源 。 近年来 在植物内生真菌中发现的活性产物的结构类型主要 有萜类 、 生物碱类 、 醌类 、 黄酮类 、 异香豆素类 、 内酯类 、 木脂素类 、 酚类 、 多肽类 、 甾体化合物等 1, 报道的 生物活性有抗肿瘤 、 抗菌 、 抗氧化 、 抗疟 、 抗病毒 、 杀虫 、 酶抑制剂 、 调节植物生长等2

6、, 在医药 、 农业和工业等各个领域都展现出良好的应用前景 。白木香 Aquilaria sinensis (Lour. Gilg. 别名土 沉香 、 女儿香 、 莞香 , 为瑞香科 Thymelaeaceae 、 沉香 属 Aquilaria 植物 , 是一种热带或亚热带常绿乔木 ,为我国华南地区特有的珍贵药用植物 , 也是我国生产中药沉香的唯一资源植物 。 由于白木香植物的特 殊性 , 研究其内生真菌的多样性及从其内生真菌中 寻找抗肿瘤抗菌等活性物质具有重要研究意义和研 究价值 。 本实验室王磊等从采自广东省不同组织年 龄的白木香根 、 茎 、 叶以及天然结香部位分离获得了 50株内生真菌

7、 3。 作者等对其进行了抗肿瘤抗菌 活性筛选 , 得到了几株具有较好生物活性的目标菌 株4, 从白木香内生真菌螺旋木霉 Trichoderma spir-ale 中分离鉴定了 1个具有抗肿瘤活性的化合物木霉酸 (trichodermic acid 5。 本研究对白木香内生真菌中具有较好的抗肿瘤活性的多节孢 Nodulispori-um sp. A4的发酵液和菌丝体中的化学成分进行了 研究 ,得到了 1个新天然产物 (1 和 9个已知化合 物 , 其中化合物 2,3, 7, 10为首次从该属真菌中分 离得到 , 见图 1,化合物 3和 4对肿瘤细胞 SF-268和 NCI-H460的增殖具有一定

8、的抑制作用 。 1材料 1. 1菌种白木香内生真菌 A4为本实验室从广东省信宜·6723·第 36卷第 23期 2011年 12 月Vol. 36, Issue 23December ,2011 图 1化合物 1 10的结构式市人工栽培白木香 (约 5a 的茎部分离得到 3, 保 存于广东省微生物研究所 。 经形态学鉴定和分子鉴定 , 该 菌 株 为 多 节 孢 Nodulisporium sp. (ITS 序 列 GenBank 登录号为 EU781661 , 保存于广东省微生 物研究所 。 1. 2仪器核磁共振波谱仪 AVANCE III 500MHz ,Bruker

9、公司 ; 质谱仪 API 2000LC-MS /MS, MDS SCIEX 公 司 ; PZ1000B 旋转式大容量普通摇床 , 武汉瑞华仪器设备有限公司 ; RE-2000型旋转蒸发仪 , 上海亚荣生 化仪器厂 ; SHZ-D ( 型循环水式真空泵 , 巩义市英 峪予华仪器厂 ; DLSB-5/10低温冷却液循环泵 , 郑州 长城科工贸有限公司 ; Hangping FA2004电子分析天平 , 上海天平仪器厂 ; 超净工作台 , 上海恒益科技有 限公司 。 1. 3试剂柱色谱硅胶 (100 200目 ,200 300目 、 GF 254高效薄层硅胶板 , 青岛海洋化工厂 ; C 18反 相

10、 硅 胶(40 75m , Fuji Silysia Chemical Ltd. ; 凝胶 Seph-adex LH-20(18 110m , Amersham Biosciences ; 石 油醚 、 乙酸乙酯 、 氯仿 、 甲醇 、 乙醇等有机溶剂均为国 产分析纯试剂 ; 麦角甾醇 、 过氧化麦角甾醇和啤酒甾 醇标准品均为本实验室以前分离获得的 , 经过质谱 和核磁共振谱图确认过其结构 。 2发酵培养从保藏菌株的试管斜面挑取少许菌丝分别接种 到马铃薯葡萄糖琼脂培养基 (PDA 平板上活化 3d , 然后将活化的菌丝接种于装有 250mL 马铃薯葡萄糖 (PD 液体培养基的 500mL 的三

11、角瓶中 , 28 , 150r ·min 1培养 5d , 作为种子液 。 大量发酵 同样采用 PD 液体培养基 , 每只 1000mL 摇瓶装500mL 的 培 养 基 , 共 培 养 80瓶 , 28 , 150r ·min 1培养 7d , 共得 A4发酵物 40L 。 3提取与分离发酵结束后过滤得发酵液和菌丝体 , 发酵液用 1/2体积乙酸乙酯萃取 4次 , 合并乙酸乙酯相于 40 下减压浓缩至膏状 , 得发酵液粗提物 (14. 9g ; 菌 丝体干燥 (204g 粉碎后用 2L 95%乙醇浸提 4次 , 于 40 下减压浓缩至无醇味 , 然后加 1L 水悬浮 ,

12、用 1L 乙酸乙酯萃取 4次 , 合并乙酸乙酯相于 40 下减压浓缩至膏状 , 得菌丝体粗提物 (16. 0g 。 发酵液粗提物 (14. 3g 通过正相硅胶 (400g 柱色谱进行初步分离 。 干法上样 , 以石油醚 -乙酸乙 酯和氯仿 -甲醇洗脱系统进行梯度洗脱 , 分段收集 。 用薄层色谱 (TLC 检测 (显色剂为茴香醛 -浓硫酸试 剂 , 合并相似组分 , 回收溶剂后得 20个粗组分 (F1-F20 。 F1组分 (196. 4mg 经 Sephadex LH-20凝胶 柱色谱以氯仿 -甲醇 (1 1 洗脱和 C 18反相硅胶柱色 谱以甲醇 -水 (8 2 洗脱得到化合物 5(15m

13、g ; F4组分 (111. 3mg 经反复重结晶得到化合物 6(38. 7mg ; F6组分 (56. 6mg 经 Sephadex LH-20凝胶柱 色谱以氯仿 -甲醇 (1 1 洗脱得到化合物 2(15. 6mg ; F7组分 (263. 2mg 经 Sephadex LH-20凝胶柱 色谱以氯仿 -甲醇 (1 1 洗脱和 C 18反相硅胶柱色谱以甲醇洗脱得到 2个组分 F7-1和 F7-2, F7-1组分 (19. 5mg 再经制备薄层色谱以石油醚 -乙酸乙酯 (20 1 展 开 得 到 化 合 物 3(3. 8mg , F7-2组 分(16. 1mg 再经制备薄层色谱以石油醚 -乙酸

14、乙酯 (8 1 展 开 得 到 化 合 物 4(12. 3mg ; F10组 分 (756. 8mg 经 Sephadex LH-20凝胶柱色谱以氯仿 -甲醇 (1 1 洗脱和 C 18反相硅胶柱色谱以甲醇 -水(8 2 洗脱得到化合物 1(58. 6mg ; F14组分 (1. 3·7723·第 36卷第 23期 2011年 12 月Vol. 36, Issue 23December ,2011g 经 Sephadex LH-20凝胶柱色谱以氯仿 -甲醇 (1 1 洗脱和硅胶柱色谱以石油醚 -乙酸乙酯 (2 1 0 1 洗脱得到化合物 7(497. 9mg 。菌丝体粗提物

15、 (15. 6g 通过正相硅胶 (400g 柱色谱初步分离得 18个粗组分 (J1-J18 。 J10组分 (1. 2g 经反复重结晶得到化合物 8(1. 1g ; J12组 分 (212. 4mg 经硅胶柱色谱以石油醚 -乙酸乙酯 (8 1 洗脱和反复重结晶得到化合物 9(10. 5mg ; J16组分 (802mg 经 Sephadex LH-20凝胶柱色谱以氯 仿 -甲醇 (1 1 洗脱和 反 复 重 结 晶 得 到 化 合 物 10 (80. 2mg 。4结构鉴定化合物 1无色油状物 , ESI-MS m /z151M + Na +, 2792M +Na +。 1H-NMR (CDCl

16、3, 500 MHz :5. 95(1H , ddd , J =17. 2, 10. 7, 5. 8Hz , H-2 , 5. 45(1H , d , J =17. 2Hz , H-1a , 5. 36 (1H , d , J =10. 7Hz , H-1b , 4. 27(1H , m , H-4 , 4. 19(1H , m , H-3 , 4. 03(1H , m , H-6 , 2. 41 (1H , ddd , J =13. 6, 6. 5, 7. 7Hz , H-5a , 1. 59 (1H , ddd , J =13. 6, 6. 7, 2. 6Hz , H-5b , 1. 35

17、(3H , d , J =6. 2Hz , H-7 ; 13C-NMR (CDCl 3, 125 MHz :133. 6(C-2 , 118. 6(C-1 , 83. 8(C-3 , 73. 9(C-4, C-6 , 42. 6(C-5 , 22. 0(C-7 。 在 H-H COSY 谱图上 , H-2与 H-1, H-3相关 , H-5与 H-4, H-6相关 , H-6与 H-5, H-7相关 ; 在 HMBC 谱图上 , H-1与 C-2, C-3相关 , H-3与 C-1相关 , H-5与 C-3, C-7相 关 , H-7与 C-5, C-6相 关 。 根 据 1D-, 2D-NM

18、R 和 MS 数据可以推断出化合物 1为 5-methyl-2-vinyltetrahydrofuran-3-ol , 其结构式如图 1所示 。 有 文献 6-7报道在合成的过程中得到过该结构化合 物 , 但没有报道核磁数据 。 因此 , 化合物 1为新天然 产物 , 本研究首次报道其核磁数据 。化合物 2无色油状物 , ESI-MS m /z261M +Na +。 1H-NMR (CDCl3, 500MHz :5. 97(1H , dd , J =17. 4, 10. 8Hz , H-2 , 5. 19(1H , dd , J = 17. 4, 1. 2Hz , H-1a , 5. 11(1

19、H , t , J =7. 2Hz , H-10 , 5. 01(1H , dd , J =10. 8, 1. 2Hz , H-1b , 3. 89(1H , t , J =7. 0Hz , H-6 , 1. 96(2H , m , H-9 , 1. 84(4H , m , H-4, H-5 , 1. 69(3H , s , H-12 , 1. 62(3H , s , H-13 , 1. 52(1H , m , H-8a , 1. 36(1H , m , H-8b , 1. 32(3H , s , H-15 , 1. 23(3H , s , H-14 ; 13C-NMR (CDCl 3 , 1

20、25MHz :144. 4(C-2 , 131. 6(C-11 , 124. 6(C-10 , 111. 6 (C-1 , 85. 1(C-6 , 82. 5(C-3 , 72. 9(C-7 , 37. 9(C-8 , 37. 5(C-4 , 26. 0(C-5, C-15 , 25. 7 (C-14 , 24. 2(C-12 , 22. 2(C-9 , 17. 6(C-13 。 以上数据与文献 8报道的 6-methyl-2-(5-methyl-5-vinyltetrahydrofuran-2-yl hept-5-en-2-ol 基本一致 。 化合物 3无色油状物 , ESI-MS m /z

21、261M +Na +。 1H-NMR (CDCl3, 500MHz :5. 98(1H , ddd , J =18. 1, 10. 9, 1. 1Hz , H-2 , 5. 13(1H , m , H-10 , 4. 97(2H , m , H-1 , 3. 54(1H , dd , J =10. 6, 5. 2Hz , H-6 , 2. 10(2H , m , H-9 , 1. 72 (2H , m , H-8 , 1. 68(3H , s , H-12 , 1. 62(3H , s , H-13 , 1. 54(4H , m , H-4, H-5 , 1. 14(6H , s ,H-14,

22、 H-15 ; 13C-NMR (CDCl3, 125MHz : 146. 6(C-2 , 131. 1(C-11 , 125. 2(C-10 , 110. 6 (C-1 , 77. 0(C-7 , 73. 2(C-3 , 72. 5(C-6 , 41. 6(C-5 , 32. 8(C-4 , 31. 7(C-15 , 25. 7(C-8, C-12 , 21. 6(C-9 , 19. 5(C-14 , 17. 6(C-13 。 以上数据与文献 9报道的 6-hydroxycyclon-erolidol 基本一致 。化合物 4无色油状物 , ESI-MS m /z245M +Na +。 1H-

23、NMR (CDCl3, 500MHz :4. 66(1H , m , H-12a , 4. 59(1H , m , H-12b , 2. 26(1H , m , H-7 , 2. 12(1H , m , H-10 , 2. 01(2H , m , H-4, H-5 , 1. 87(2H , m , H-2a , H-8a , 1. 72(2H , m , H-8b , H-9a , 1. 70(3H , s , H-13 , 1. 56(2H , m , H-2b , H-3a , 1. 43(2H , m , H-6a , H-9b , 1. 25 (2H , m , H-3b , H-6b

24、 , 1. 19(3H , s , H-14 , 0. 89(3H , d , J =6. 6Hz , H-15 ; 13C-NMR (CDCl 3, 125 MHz :152. 5(C-11 , 107. 7(C-12 , 74. 9(C-1 , 55. 5(C-10 , 46. 1(C-7 , 45. 8(C-5 , 38. 9 (C-4 , 36. 2(C-2 , 31. 1(C-3 , 29. 8(C-14 , 28. 6(C-8, C-6 , 26. 2(C-9 , 19. 9(C-13 , 16. 1 (C-15 。 以上数据与文献 10的报道的 rel-(1S , 4S , 5R

25、 , 7R , 10R -10-desmethyl-1-methyl-11-eu-desmene 基本一致 。化合物 5无色针晶 , ESI-MS m /z161M +Na +。 1H-NMR (acetone-d6, 500MHz :7. 05 (2H , d , J =8. 1Hz , H-3, 5 , 6. 74(2H , d , J = 8. 1Hz , H-2, 6 , 3. 69(2H , t , J =7. 1Hz , H-8 , 2. 71(2H , t , J =7. 1Hz , H-7 ; 13C-NMR (acetone-d6, 125MHz :156. 6(C-1 ,

26、131. 0(C-4 ,·8723· 130. 7(C-3, C-5 , 116. 0(C-2, C-6 , 64. 3(C-8 , 39. 5(C-7 。 以上数据与文献 11报道的酪醇 基本一致 。化合物 6无色针晶 , ESI-MS m /z175M + H +。 1H-NMR (CDCl3, 500MHz :9. 31(1H , s , 1-OH , 7. 41(1H , d , J =8. 3Hz , H-4 , 7. 36 7. 28(3H , m , H-3, H-5, H-6 , 6. 87(1H , d , J = 7. 5Hz , H-7 , 6. 78

27、(1H , d , J =7. 7Hz , H-2 ,4. 06(3H , s , 8-OCH 3 ; 13C-NMR (CDCl 3, 125MHz :156. 2(C-8 , 154. 5(C-1 , 136. 8(C-4a , 127. 7(C-3 , 125. 6(C-6 , 121. 9(C-5 , 118. 8(C-4 , 115. 1(C-8a , 110. 4(C-2 , 103. 9 (C-7 , 56. 1(8-OCH3。 以上数据与文献 12报 道的 8-甲氧基 -1-萘酚基本一致 。化合物 7无色针晶 , ESI-MS m /z211M +Na +。 1H-NMR (C

28、DCl3, 500MHz :7. 37(2H , dd , J =8. 2, 1. 4Hz , H-4, H-5 , 7. 35(2H , dd , J =8. 2, 8. 2Hz , H-3, H-6 , 6. 84(2H , dd , J =8. 2, 1. 4Hz , H-2, H-7 , 3. 97(6H , s , 1-OCH 3, 8-OCH 3 ; 13C-NMR (CDCl3, 125MHz :157. 1(C-1, C-8 , 137. 4(C-4a , 126. 3(C-3, C-6 , 120. 8 (C-4, C-5 , 117. 7(C-8a , 106. 3(C-2

29、, C-7 ,56. 5(1-OCH 3 , 8-OCH3。 以上数据与文献 13报道的 1, 8-二甲氧基萘基本一致 。化合物 8无色针晶 。 TLC 上显示为甾体类化 合物特征斑点 , 与麦角甾醇标准品进行对照 , 混合熔 点不下降 , TLC 显色与 Rf 均相同 。 故确定化合物 8为麦角甾醇 。化合物 9无色针晶 。 TLC 上显示为甾体类化 合物特征斑点 , 与过氧化麦角甾醇标准品进行对照 , 混合熔点不下降 , TLC 显色与 Rf 均相同 。 故确定 化合物 9为过氧化麦角甾醇 。化合物 10无色针晶 。 TLC 上显示为甾体类 化合物特征斑点 , 与啤酒甾醇标准品进行对照 ,

30、 混合 熔点不下降 , TLC 显色与 Rf 均相同 。 故确定化合 物 10为啤酒甾醇 。5体外抗肿瘤活性研究参考李浩华等 14采用 MTT 法测定所得纯化合 物 1 7对神经胶质瘤细胞株 SF-268和大细胞肺癌 细胞株 NCI-H460的抗肿瘤活性 , 结果表明化合物 3, 4对上述 2种肿瘤细胞株的增殖具有一定的抑制 作用 , 见表 1。表 1化合物 1 7对肿瘤细胞的抑制率(作用质量浓度 100mg ·L 1 %化合物 SF-268NCI-H460 118. 04. 6215. 66. 7389. 144. 2482. 379. 8522. 49. 3644. 015. 5

31、71. 10. 5顺铂 97. 993. 7注 :阳性对照为顺铂水溶液 (作用质量浓度 10mg ·L 1 。参考文献 1Tan R X , Zou W XEndophytes :a rich source of functional me-tabolites J Nat Prod Rep , 2001, 18(4 :4482Gunatilaka A A LNatural products from plant-associated micro-organisms :distribution , structural diversity , bioactivity , and im-

32、plications of their occurrence J J Nat Prod , 2006, 69(3 : 5093王磊 , 章卫民 , 潘清灵 , 等 白木香内生真菌的分离及分子 鉴定 J 菌物研究 , 2009, 7(1 :374李冬利 , 张庆波 , 陈玉婵 , 等 白木香内生真菌抗肿瘤抗菌 活性的筛选研究 J 微生物学杂志 , 2009, 29(5 :265李冬利 , 陈玉婵 , 李义勇 , 等 1株白木香内生真菌中抗肿 瘤活性成分的分离纯化和结构鉴定 J 微生物学杂志 , 2010, 30(6 :16Kang S H , Lee J H , Lee S BAn improv

33、ed reductive demercura-tion of organomercurials using triethylborane J Tetrahedron Lett , 1998, 39(1/2 :597Kang S H , Lee S BTotal synthesis of (+ -furanomycin J Chem Commun , 1998, 1998(7 :7618Holmes D S , Ashworth D M , Robinson J AThe bioconvertion of (3RS , E -and (3RS , Z -nerolidol into oxygen

34、ated products by Streptomyces cinnamonensis Possible implications for the biosyn-thesis of the polyether antibiotic monensin A ? J Helv Chim Acta , 1990, 73(2 :2609Jakupovic J , Lehmann L , Bohlmann F , et alNerolidol deriva-tives from Asteriscus sericeus J Phytochemistry , 1987, 26 (10 :285410Chave

35、z J P , Gottlieb O R , Yoshida M10-Desmethyl-1-methyl-eudesmanes from Ocotea corymbosa J Phytochemistry , 1995, 39(4 :84911吴少雄 , 郭亚东 , 郭祀远 , 等 大花红景天乙醇提取物的化 学成分研究 J 现代食品科技 , 2008, 24(4 :32212Dai J , Krohn K , Fl rkeU , et alMetabolites from the endophyt-ic fungus Nodulisporium spfirom Juniperus cedre

36、 J Eur J Org Chem , 2006(15 :349813黄华容 , 林永成 , 周世宁 , 等 南海红树林内生真菌 3920代 ·9723· 谢产物研 究 J 中 山 大 学 学 报 :自 然 科 学 版 , 2005, 44 (6 :137 14李浩华 , 陈玉婵 , 陶美华 , 等 毛蜂窝菌提取物体外抗肿瘤 活性的研究 J 食用菌学报 , 2009, 16(3 :57.Chemical constituents of endophytic fungus Nodulisporiumsp . A 4from Aquilaria sinensisLI Dongl

37、i 1, WU Zhengchao 1, 2, CHEN Yuchan 1, TAO Meihua 1, ZHANG Weimin 1*(1. State Key Laboratory of Applied Microbiology Ministry-Guangdong Province Jointly Breeding Base , South China ,Guangdong Open Laboratory of Applied Microbiology , Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collectio

38、n and Application , Guangdong Institute of Microbiology , Guangzhou 510070, China ;2. South China Sea Institute of Oceanology , Chinese Academy of Sciences , Guangzhou 510301, China Abstract Objective :To investigate the chemical constituents of an endophytic fungus , Nodulisporium sp. A4, from the

39、me-dicinal plant Aquilaria sinensis and search for antitumor natural products. Method :The fungus was cultured in liquid medium and ex-tracted with EtOAc. The compounds were isolated by various chromatographic methods (silica gel , reverse silica gel , Sephadex-LH20, preparative TLC and so on and recrystallization. Structural elucidation was conducted b