病毒性脑炎的诊断及博尔纳病病毒p24基因片段的检测

1、病毒性脑炎的诊断及博尔纳病病毒p24基因片段的检测         11-03-17 14:30:00     作者：马彦 王振海 孔繁元    编辑：studa20【摘要】  目的 探讨脑脊液(CSF)、脑电图(EEG)、MRI对于病毒性脑炎的诊断价值，并检测病毒性脑炎患者外周血单个核细胞(PBMCs)中博尔纳病病毒(BDV)p24基因片段，探讨病毒性脑炎与BDV感染的关系。方法 回顾性分析病毒性脑炎患者的CSF、EEG、M

2、RI的阳性检出率并进行比较，用荧光定量巢式逆转录聚合酶链反应(FQ-nRT-PCR)方法检测病毒性脑炎患者及对照者PBMCs中BDVp24基因片段，并总结阳性患者的临床特征。结果 CSF、EEG、MRI检查结果比较，CSF高于MRI检查结果阳性率(2=9.6，P0.01)；CSF高于EEG检查结果阳性率(2=7.58，P0.01)；MRI检查阳性率高于EEG(2=5.82，P0.01) 。PBMCs中BDVp24基因片段检测结果显示实验组4例阳性，对照组均为阴性。4例BDVp24基因片段阳性患者主要以发热、头痛、颅内压增高症状为主。结论 脑脊液、MRI对病毒性脑炎的诊断价值优于EEG，部分病毒

3、性脑炎的发生与BDV感染有关，主要以发热、头痛、颅内压增高为临床特征。 【关键词】  病毒性脑炎；脑脊液；博尔纳病病毒；荧光定量巢式逆转录聚合酶链反应 病毒性脑炎(Virus encephalitis，VE)的诊断主要靠临床症状、体征和脑脊液(CSF)检查。临床常出现发热、头痛、精神行为异常以及意识水平的改变，可伴有局灶性神经缺损和癫痫发作。博尔纳病病毒(BDV)是一种中枢神经系统新发感染性病毒，研究表明其与人类某些神经精神疾病的发病有关1。本文拟探讨CSF、脑电图(EEG)和MRI对VE的诊断价值，并检测BDVp24基因片段以探讨其与VE的关系。  &

4、#160; 1  资料与方法    1.1  一般资料  实验组50例(男27例，女23例)，年龄1578岁，平均34.336岁，均为宁夏医科大学附属医院神经内科2007年7月2008年7月间的住院患者。正常对照组60例(男33例，女27例)，年龄1875岁，平均 53.662岁，均来自本院健康体检者。实验组50例均符合临床神经病学病毒性脑炎的诊断标准：临床上有似病毒感染所致脑实质受损征象；脑脊液有或无炎症性改变，均查不到细菌(包括结核、霉菌等)感染的证据；脑电图呈弥漫性异常(有些可局灶化)，脑扫描、造影、MRI等检查无占位性病变征象

5、(单纯疱疹病毒脑炎和某些局灶性脑炎例外)；血清抗体滴度明显增高(特别是恢复期比急性期高4倍以上)。并排除结核性脑膜炎、化脓性脑膜炎等颅内感染。实验组和对照组一般情况差异无统计学意义。    1.2  方法  脑脊液采用英国Shandon公司Cytospin2型细胞波片离心沉淀仪收集，应用迈格姬染色法染色。细胞学诊断参照实用脑脊液细胞学彩色图谱2。脑电图检测均采用日本光电32道数字化视觉脑电监测仪，评定参考刘晓燕临床脑电图学3标准。颅脑MRI采用美国GE公司1.5T Signa Infinity Twin Speed 型MR机，层厚6mm，间隔2

6、mm，横断面、矢状面及冠状面T1WI400ms/20ms，T2WI3 640ms/89ms。试剂和其它材料包括：Ficoll-conray液，Trizol RNA提取抽提剂，BDV p24荧光定量PCR检测试剂盒(购自广州达辉生物技术有限公司)。BDV重组质粒由重庆医科大学神经病学研究所提供。BDV p24基因扩增产物及探针序列：外引物P1:5-TGACCCAAACCAGTAGACCA-3(19bp)，P2：5GTCCCATTCATCCGTTGTC-3(19bp)；内引物P1:5-CCCTCCAAGTGGAAACCAT-3(19bp)，P2：5CAGTATCTTGATGTTCTCGCCA-3

7、(22bp)；荧光探针：5FAM-TCAGCGGTGCGACCACTCCGATAGC-TAMRA-3(25bp)。    采集每例患者及对照者EDTA抗凝外周血液各5mL，分别用Ficoll-conray液密度梯度离心法分离外周血液单个核细胞(PBMC)，采用Trizol一步法提取细胞总RNA，标本置80保存备用。然后进行(1)RNA完整性检测：采用1琼脂糖凝胶(含溴化乙锭浓度为0.5)电泳。取RNA样品5L加样，以34V/cm电压电泳1h，在凝胶扫描系统中观察结果并照相。(2)BDV质粒标准曲线制作：将重组质粒定量后作为阳性模板，稀释完全107、106、105、

8、104、103拷贝/L浓度梯度，在澳大利亚Rcorbett型扩增检测仪上进行PCR扩增，由电脑自动分析出定量结果，并给出PCR扩增的动力学曲线。(3)FQ-nRT-PCR检测BDV p24基因片段：首先进行逆转录反应，在含RNA的Ep管中加入逆转录体系反应液7L，逆转录酶1L，DEPC水7L，总反应体积为20L，于37 持续1h然后取逆转录产物5L，加入反应液8L，TaqDNA聚合酶1L，去离子水11L，反应体积为25L，进行PCR第一步扩增:93 4min预变性，94变性30s，54退火30s，72延伸1min，循环20个周期。再取PCR第一步扩增产物5L，加入反应液14L，TaqDNA聚合

9、酶1L，去离子水30L，反应体积为50L，进行PCR第二步扩增：93 3min预变性，93变性45s，55延伸60s，共循环40个周期。每次实验均设阴性对照。(4)PCR扩增阳性产物的鉴定和序列分析：将BDV p24基因片段阳性PCR第二步扩增产物5L加样，以2琼脂糖34V/cm电压电泳35min，在凝胶成像系统中扫描并照相。可见与目的基因片段相同分子量大小86bp电泳条带。将BDV p24基因片段阳性的标本经纯化、克隆后送上海英骏生物技术有限公司基因测序。    1.3  统计学方法    计数资料采用2检验。BDVp24

10、基因片段检测采用SPSS 13.0进行Fisher精确概率检验。    2  结果    2.1  CSF、MRI、EEG检查结果比较  50例患者均于入院24h内行腰穿脑脊液检查，脑脊液常规外观48例为无色透明清亮，2例为微混浊淡血性；其中压力正常者22例，压力增高者26例(200mm H20为颅压增高)，介于200330mm H20间22例，330mm H20有4例，脑压降低(70mm H20)2例；脑脊液细胞学正常5例，细胞学异常45例(细胞数5×106/L为脑脊液细胞学异常)，阳性率为9

11、0，细胞数1049×106/L 11例，细胞数5099×106/L 15例，细胞数100499×106/L 16例，细胞数5001000×106/L 3例；脑脊液生化检查：蛋白增高0.45 g/L者33例，其中5例增高至1.0 g/L以上；糖、氯化物均正常；脑脊液涂片均未查到细菌。脑脊液病毒免疫学检查均阴性，详见表1。表1  50例病毒性脑炎患者住院24hCSF检测结果    2.2  实验组患者PBMCs中BDVp24基因片段阳性率(8%)，对照组均为阴性(0%)，差异有统计学意义(P0.05)。

12、60;   2.3  PCR扩增阳性产物鉴定  BDVp24基因片段阳性患者的总RNA逆转录产物cDNA经PCR扩增后，其终产物经电泳后在紫外线下观察，可见与目的片段大小一致的86bp电泳条带(见图1)。测序后证实是BDV基因片段。    2.4  BDVp24基因片段阳性患者的临床特征    4例BDVp24基因片段阳性患者均有发热、头痛和CSF细胞学异常，4例有局灶体征和脑膜刺激征，脑CT或MRI异常3例，意识障碍2例。发病前均无上感或腹泻史，以发热、头痛、颅高压为临床特征。

13、60;   3  讨论    病毒性脑炎大多数急性或亚急性起病，以头痛、发热或行为异常为首发症状，其诊断标准主要依靠临床表现和脑脊液实验室检查结果。本组50例患者均于入院24h内行脑脊液细胞学检查，细胞学异常者45例，阳性率为90，细胞学主要表现为以淋巴细胞反应为主，这符合病毒性脑炎脑脊液细胞学的特点4。本组资料脑脊液生化显示糖、氯化物均正常，蛋白升高33例，其中5例增高至1.0 g/L以上。50例患者均同时行脑脊液涂片检查和脑脊液病毒免疫学检查均为阴性。虽从脑组织或脑脊液中分离出病毒是诊断病脑的金标准，但脑脊液病毒分离的阳性率很低(

14、4)且技术条件上不利于早期诊断和推广4，因此脑脊液检查仍是诊断病毒性脑炎的重要实验室依据，也是与细菌性脑炎、结核性脑炎进行鉴别诊断的主要依据。且与EEG、MRI阳性率进行统计学比较均差异有统计学意义，表明CSF对于病毒性脑炎的诊断价值优于其他二项。本组MRI平扫45例，阳性率68.89。这与MRI对自由水的变化极为敏感有关，脑组织中水分的轻微变化即可引起MRI信号强度的明显改变5。在MRI异常的31例病例中，FLAIR序列异常28例，长T1WI 14例，长T2WI 18例，提示FLAIR序列的敏感性更强，这是因为FLAIR序列抑制了CSF信号，使CSF信号减弱为零，从而可避免CSF产生的部分容积效应及流动性伪影干扰病灶的显示6，在靠近CSF的区域形成了病变的高对比，弥补了T2WI的不足5-6。EEG检查43例中异