牛磺酸对血管紧张素Ⅱ改变培养心肌细胞内游离Ca2+浓度作用的影响

1、    牛磺酸对血管紧张素改变培养心肌细胞内游离 Ca2+浓度作用的影响         摘要 目的和方法：用Fura-2AM荧光显示测定细胞内游离Ca2+浓度(Ca 2+i)的方法，我们研究了牛磺酸(Tau)对血管紧张素(Ang )引起的培养心肌细胞 Ca2+i变化的影响。结果：在有Ca2+和无Ca2+的缓冲液 中，Ang (1,10，100，1 000 nmol/L)能浓度依赖性地引起Ca2+i升高。在含Ca 2+的缓冲液中，Tau(10,20 mol/L)可依

2、浓度地抑制Ang (100 nmol/L)引起的Ca 2+i升高;但在无Ca2+的缓冲液中，牛磺酸无此作用。用ryanodine(Rya，1 m ol/L)预先耗竭细胞内贮存的Ca2+后，Ang (100 nmol/L)仍能 引起Ca2+i进一步升高：Ang 的这一作用能被Tau(20 mmol/L)显著抑制。 结论：在培养的乳鼠心肌细胞，Tau能够通过抑制Ang 引起的Ca2+内流而拮抗 Ang 升高Ca2+i的作用。关键词：牛磺酸；血管紧张素；心肌细胞；钙中分类号：Q813.1文献标识码：A文章编号 ：1000-6834(2000)01-0026-04EFFECTS OF TAURINE

3、ON CHANGES OF CYTOSOLIC FREE Ca2+ INDUCED BY ANGIOTENSIN IN CULTURED MYOCARDIAL CELLSGE Hui1, TAO Liang2, LIU Pei-qing3, MA Jing1, LI NG Wen-hua1(1.Department of Nutriology;2.Department of Pharmacology;3.Dea prtment of Physiology, Sun Yet-Sen University of Medical Sciences, Guangzhou 51 0089)ABSTRAC

4、TAim and Methods: The effects of taurine (Tau) on the Ca2+ movement induced angiotensin were observed in cultured myocardial cells of neonatal r ats with the fura-2 probe. Results: Ang (1,10,100,1 000 nmo l/ L) increased Ca2+i dosedependently in both Ca2+ containing medi um and Ca2+ free medium. The

5、 rising Ca2+i evoked by Ang (100 n mol/L) were decreased by Tau(10,20 mmol/L)in a concentration-dependent manner i n Ca2+ medium but not in Ca2+ free medium. After depletion of intrac ellular Ca2+ pools with ryanodine (1 mol/L), Ang caused another increa se in Ca2+i. This Ang -induced increase in Ca

6、2+i was mark edly inhibited by Tau (20 mmol/L). Conclusion: These results indicat e that the mechanism of antagonistic effects of Tau on Ang -induced Ca2+ movement is related to Tau inhibitory action on the Ca2+ influx evoked b y Ang .KEY WORDS：taurine;angiotensin ;myocardium cells;calcium 牛磺酸(tauri

7、ne，Tau)是心脏中含量最丰富的游离氨基酸，近年来发现它有降低血压，保护缺血心肌，强心和抗心律失常等多种作用，但作用机理不明1。 我们的研究发现2,3：在肾性高血压大鼠，Tau能降低血压，并能降低电刺激引 起的心律失常发生率;并能减少心肌线粒体Ca2+的含量。在培养的心肌细胞，Tau能够 抑制血管紧张素 (Angiotensin ，Ang)加快心肌细胞搏动率和增加动作电位振幅、 复极时间及窦性周长的作用。这些结果表明：Tau能拮抗Ang 的作用。Ang通过激活心 肌细胞表面的Ang1受体(AT1受体)而影响心脏的多种功能(如：收缩、代谢、生长、 兴奋和传导等)，并在许多心血管疾病的发生和发展

8、中起重要的作用4。我们认为 Tau对Ang 的拮抗作用可能是通过干扰Ang 对心肌细胞Ca2+代谢的影响而产生的 。为了证实这一推测，本文用fura-2荧光显示测定培养乳鼠心肌细胞内游离Ca2+浓 度(Ca2+i)的方法，研究了Tau对Ang 引起的Ca2+转运变化的影响。1材料和方法11药品fura-2AM粉剂(sigma)，用DMSO溶解稀释为1 mmolL的溶液，储存于-20冰箱内备 用。ryanodine(Rya)由香港大学生理系馈赠，Ang 、Tau、bromodeoxy-uridine(BDU)购 于sigma公司。其余药品、试剂为市售分析纯。12心肌细胞培养按文献4的方法，在无菌

9、条件下取生后24 d的SD大鼠(中山医科大学实验动物中心 提供)的心室，置于Hanks液中剪碎，用006%的胰蛋白酶溶液在磁力搅拌下分散细胞，温 度控制在(37±1)；每10 min收集一次细胞，离心后将所得的全部细胞置于含有10%胎牛血 清、青霉素100u、链霉素100 g100 ml的DMEM培养基中制成15×106cellml的悬 液，并加BDU(01 mmolL)抑制非心肌细跑生长。将心肌细胞悬液接种于培养瓶中，送入 通 以5CO2和95空气的CO2培养箱中培养。每24 h用含10胎牛血清的培养基换液一次 。本实验所采用的细胞为培养48 h，已开始出现自发性搏动的心

10、肌细胞。13心肌细胞Ca2+i的测定5131培养心肌细胞fura-2AM的负载 培养的心肌细胞用006的胰蛋白酶消化后制成细跑悬液，加入2 molfura-2/AM，在37条件下孵育30min后，加5倍体积的DMEMF12(含005BSA)在室温下静置5 min。500 r/min离心2 min，用BSS缓冲液(mmolL:NaCl 130，KCl 5，MgCl2 1，CaCl2 15，HEPES 20，Glucose 10，BSA 1g，pH 74)悬浮细胞，调节细胞密度至3×106cell/ml。将细胞转至石英测量杯中，移入RF-5000荧光分光光度计，在37恒温、磁力搅拌下测定

11、细胞Ca2+i。若作细胞外无Ca 2+测定，样品最后一次离心前换成无Ca2+的BSS，离心后用无Ca2+的BSS悬 浮细胞，并于测量前1 min在样品中加入200 mol的 EGTA。所有实验用试剂都经证明无荧 光干扰。132心肌细胞Ca2+i的测定 用RF-5000荧光分光光度计(日本岛津公司)测定心肌胞Ca2+i。激发光波长分别为340 nm和380 nm，发射光波长为505 nm，采样间隔为1 s。连续记录心肌细胞在给药前后的荧光强度。根据文献6，心肌细胞Ca2+i的计算公式为： Ca2+i= Kd×Sb1Sb2×(R-Rmin)(Rmax-R)式中R为实验记录到的两

12、激发光波长的荧光比值(F340F380)；Kd为fura-2 Ca2+的解离常数。据文献6报道，在37下，其Kd值为224 nmol/L。Rmax 为胞内fura-2被Ca2+饱和时两激发光波长的比值。实验中通过加入triton X-100( 终浓度为009)测得;Rmin为 fura-2完全游离，未与Ca2+结合时两激发光波长的 荧光值，通过加入EGTA(终浓度为6 mmol/L)测得；Sb1Sb2：为Fura-2在无Ca2+以 及与Ca2+结合达到饱和时，于380 nm激发光处的荧光强度之比。细胞自身荧光在没有负载fura-2AM时进行测定。计算Ca2+i前应减去细胞自身的荧光。Tau，R

13、ya和Ang 直接加入细胞悬液中，记录加药前后的荧光比值。1.4统计学处理结果采用均数±标准差(<"0 (881 bytes)" src="/med/cano/201003/20100309171148427" 12 14>±s),并进行t检验。2结果21心肌细胞的静息Ga2+i本实验测得心肌细脑内静息Ca2+i的平均浓度在含Ca2+的缓冲液中为( 842±34 nmol/L);在无Ca2+液中为(57±62 nmol/L)。Tau 5，10，20 mmol/L均不影响心肌细胞静息Ca2+i(表1)。T

14、ab.1Effect of Tau on Ca2+i in cultured myocardialcells of neonetal rat (<"0 (881 bytes)" src="/med/cano/201003/20100309171148427" 12 14>±s,n=6)GroupCa2+i (nmol/L)Ca2+ cantaning BSSCa2+ free BSSControl84.2±3.457.0±6.2Tau(mmol/L)582.8±4.157.9±3.81081.

15、6±5.456.6±3.22080.5±3.555.3±4.5     22Ang 对心肌细胞Ca2+i的影响Ang (1，10，100和1 000 nmolL)呈浓度依赖性地增加心肌细胞Ca2+i(1);在无Ca2+的BSS中，上述浓度的Ang 也呈浓度依赖性地增加Ca2+i (2)。在含Ca2+和无Ca2+的BSS中，特异的AT1受体拮抗剂Sar1，Val 5，Ala8-Ang 可完全抑制Ang升高Ca2+i的作用。在含Ca2+B SS中，用Rya(1 molL)预先处理心肌细胞，给药3min后Ca2+i增加了

16、73； 在此基础上加Ang (100nmol/L)，心肌细胞Ca2+i进一步增加80(表2)。 Tab.2Effect of Rya (1 mol/L), Tau (20 m mol/L) andAng (100 nmol/L) on Ca2+i in cultured myocar dialcells of neonetal rat (<"0 (881 bytes)" src="/med/cano/201003/20100309171148427" 12 14>±s,n=6)GroupCa2+i (nmol/L)Control85

17、±13Rya147±16*Rya+Tau144±19*Rya+Ang318±18*Rya+Ang+Tau267±21*#     *P<0.01, vs control; # P<0.01, vs Rya+Ang     Fig.1Effects of Ang (1,10, 100,1 000 nmol/L) and Sar1, Val5, Ala3-Ang (1 mol/L) on Ca2+i in cultured rat myocardiac ce

18、lls in Ca2+ medium (<"0 (881 bytes)" src="/med/cano/201003/20100309171148427" 12 14>±s, n=6)*P<0.01, vs Ang 0 nmol/L;# P<0.01,vs Ang 23Tau对Ang 诱导Ca2+i变化的影响在有Ca2+的BSS中，Tau(10，20 mmolL)能抑制Ang 引起的Ca2+i 升高，抑制率分别为28和38。但在无Ca2+的BSS中，上述浓度的Tau对Ang 引起的Ca2+i增加无显著影响。Tau(20

19、mmolL)对Rya升高心肌细胞Ca2+i 的作用无影响，但能明显抑制用Rya预先处理后再加Ang 引起的Ca2+i升高(3 ，表2)。     Fig.2 Effects of Ang ( 1,10, 100,1000 nmol/L) and Sar1, Val5, Ala3-Ang (1 mol/L) on C a2+i in cultured rat myocardiac cells in Ca2+ free medium (<"0 (881 bytes)" src="/med/cano/201003/20100

20、309171148427" 12 14>+s,n=6)*P<0.01, vs Ang 0 nmol/L; #P<0.01, vs Ang      Fig.3 Effects of Tau (5,10,2 0 mmol/L) on the changes of Ca2+i induced by Ang (100 nmol/L) (<"0 (881 bytes)" src="/med/cano/201003/20100309171148427" 12 14>+s,n=6)*P&

21、lt;0.01, vs Tau 0 mmol/L3讨论大量的研究表明：Ang 是与许多心血管疾病(如高血压、充血性心力衰竭、心律失常等)的发生密切相关的体液因子。Ang对心脏功能和结构的作用，主要是通过影响心肌细胞内Ca2+代谢，升高Ca2+i而产生的2。 本研究证实：Ang 能浓度依赖性的增加心肌细胞Ca2+i；Ang 的这一作用能 被特异的AT1受体拮抗剂Sar1，Val5，Ala8-Ang 所阻断，这表明Ang升 高Ca2+i的作用是由AT1受体介导的。在心肌细胞，受体激动主要通过两种途径 引起Ca2+i升高：细胞外Ca2+内流和细胞内肌浆网内质网贮存的Ca2 +释放 。Rya为肌浆网内

22、质网膜上Rya敏感Ca2+释放通道的选择性激动剂，它持续开放Rya 敏感Ca2+释放通道，使肌浆网内质网中的Ca2+流入胞浆，导致Ca2+ i升高。在Rya持续作用下，肌浆网内质网中的Ca2+可被耗竭。本研究观察到，在 含Ca2+和无Ca2+的缓冲液中 Ang 均能引起心肌细胞Ca2+i升高； 并且用Rya耗竭心肌细胞内Ca2+贮存池后，Ang 仍然可以增加Ca2+i;这 表明：Ang 可通过增加细胞外Ca2+内流和促进胞内Ca2+释放两种途径引起 Ca2+i升高。我们以前的研究发现，牛磺酸在体内和体外都能抑制Ang 对心肌细胞的作用；并推测：牛磺酸的这一作用可能是通过干扰Ang 对心肌细胞C

23、a2+代谢的影响而产生的3,4。本研究的结果表明：牛磺酸能够依浓度地抑制Ang 引起的心肌细胞Ca2+i升高：这一结果证实了我们的推测。本研究发现，牛磺酸在有Ca 2+的缓冲液中能抑制Ang 升高Ca2+i的作用：而在细胞外无Ca2+时 ，牛磺酸则无此作用。牛磺酸对Rya引起的Ca2+i升高无影响，但能显著抑制用Ry a后Ang 引起的Ca2+i升高。这证明牛磺酸不影响Ang 引起的Ca2+释放 ；它可能是通过抑制Ang 引起的Ca2+内流而降低心肌细胞Ca2+i的。作者简介：葛慧(1959-),女，青岛人，副教授，从事食品营养学研究葛慧(中山医科大学公共卫生学院营养系)陶亮(药理学教研室)刘培庆(生理学教 研室，广州510089)马静(中山医科大学公共卫生学院营养系)凌文华(中山医科大学公共卫生学院营