血红素氧合酶-1基因转染对器官移植的作用研究

1、血红素氧合酶-1基因转染对器官移植的作用研究 10-09-03 15:23:00 编辑：studa20 作者：刘立青张黎陈洪元苗瑞政【摘要】 血红素氧合酶(heme oxygenase，HO)是体内唯一催化血红素分解代谢的限速酶，可以氧化降解血红素，将其分解为CO、Fe2+和胆绿素。HO有3种同工酶，其中HO-1是血红素降解的起始酶和限速酶，是唯一可以被诱导的HO。HO-1作为移植器官存活的关键“保护基因”，通过基因转染使其稳定过表达，能显著减轻移植器官的缺血再灌注损伤,提高移植物存活率。 【关键词】 血红素氧合酶-1基因转染器官移植血红素是具有潜在危害性的物质，缺血再灌注损伤(ischemi

2、a/reperfusioninjury，IRI)时细胞内外的血红素来源增加，通过脂质过氧化及氧自由基损害细胞的结构。血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)除降解血红素发挥抗氧化作用外，血红素的3种降解产物均具有重要的生理功能1;胆红素、胆绿素是体内强抗氧化剂;CO是机体内源性CO的主要来源，具有扩血管和抗血小板聚集的特性，还是多种生理过程的胞内信使，在维持内环境稳定和信息传递中发挥重要作用;Fe2+是体内多种细胞内酶和氧化蛋白的重要辅基，可减少活性氧的产生。通过基因转染使HO-1过表达,研究其在各器官移植中的作用,是目前研究的一个热点。1HO-1基因转染与肝脏移植Jae

3、schke等2发现,在缺血再灌注后,老鼠肝脏的损伤分为两个明显的阶段:第一阶段(灌注后2 h)以Kupffer细胞诱导的氧化应激为特征。Kupffer细胞产生并释放、活化氧自由基，导致急性肝细胞损伤;第二阶段以中性粒细胞介导的炎症损伤为特征，在第一阶段活化的Kupffer细胞及损伤的肝细胞释放多种促炎因子，聚集的中性粒细胞释放大量氧自由基及蛋白酶，致使细胞溶解、凋亡。而HO-1降解系统本身即可消耗3分子O2和7个电子，发挥强大的抗氧化作用。除降解血红素外，HO-1主要通过其酶解产物发挥作用，显著延长同种移植肝的存活时间。Vachharajani等3研究表明胆绿素通过抑制补体、调节P-选择素与E

4、-选择素来抑制中性粒细胞浸润，发挥抗炎作用。低浓度的CO(COHb/Hb20%)通过下调促炎因子和黏附分子的表达,减少炎细胞浸润,发挥抗炎作用。而CO的抗凋亡机制可能有多个途径，如通过P38 MAPK途径、通过调节凋亡因子BAX、p53和抗凋亡因子Bcl-2的表达等4。 研究表明HO-1可以显著改善肝脏的氧化应激状态，提高其抗氧化能力，清除再灌注后产生的氧自由基，减轻供体肝脏移植后再灌注损伤5。国外学者研究发现大鼠同种异体肝移植术前24 h如果给供体静脉注射腺病毒与HO-1cDNA重组体(实验组)，术后14 d其存活率约为80%，明显高于对照组40%。对照组术后肝细胞气球样变性、门脉区水肿、中

5、性粒细胞渗出、肝细胞坏死程度等均明显高于实验组，而胆汁生成量却明显降低，表明通过外源性基因导入提高HO-1的活性，可增加门静脉血流量，促进胆汁生成，降低肝细胞损伤程度，提高肝移植术后生存率6。Yang等7的研究结果显示大鼠肝移植术前48 h供体注射编码有HO-1基因的腺病毒，移植后无论对整体肝脏移植还是减体积肝移植(40%供肝)均能明显提高术后存活率，对减体积肝移植尤为明显。作者分析认为通过外源途径增强HO-1基因表达，在移植术后再灌注早期阶段，HO-1通过降低黏附分子的水平、减少炎症介质和细胞因子的合成等机制，提高肝移植术后生存率。Coito8分析认为，HO-1基因转染能提高肝移植的存活率，

6、可能通过以下途径：1) 抑制iNOS的活性;2)提高抗凋亡蛋白Bcl-2和Bag-1的合成;3)抑制门脉区炎性细胞的聚集。Ke等9的研究则表明， HO-1通过抑制CD95/FASL介导的凋亡和CO信号传导途径等发挥作用，HO-1基因转染后的供体肝移植术后的排斥反应程度明显低于未转染组，而且生存率明显提高。经HO-1基因转染处理的zucker大鼠肝移植存活率可达80%，明显高于对照组的40%50%10。2HO-1基因转染与心脏移植目前研究认为HO-1的表达具有保护心脏的作用，并能延长异种移植心脏的存活时间11。以腺病毒为载体将HO-1基因通过静脉途径注射到大鼠供体心脏，然后行同种异体心脏移植术，

7、结果基因转染组大鼠存活时间明显高于对照组12。国外学者在大鼠移植心脏冷保存期间，经冠状动脉途径，将以质粒为载体的HO-1基因注入供心进行转染，移植术后0100 d全时观测HO-1的活性与移植心脏存活率的关系，结果发现心脏移植术后HO-1基因稳定持续表达，通过降低移植物组织重构、抑制组织内纤维化、减轻炎症反应和细胞损伤等多种途径提高术后存活率，表明促进保护性基因的表达及降低移植物内部的炎症反应可抑制宿主对移植物的免疫排斥反应;研究还发现术后早期(030 d)HO-1的活性对降低移植心脏动脉硬化没有明显作用，但术后30100 d HO-1的活性对降低移植心脏动脉硬化具有明显作用，提示在器官移植术后

8、早期，HO-1的作用主要表现为降低炎症反应;后期则主要参与降低慢性排斥反应13。Araujo等14研究结果也表明在HO-1转基因小鼠心脏移植后，HO-1的表达程度与移植心脏的血管炎性程度和炎性细胞渗出数量成反比，而且与对照组相比，HO-1表达增强可显著提高移植物的存活率。Tsui 等15发现,以HO-1基因转染供体心脏可调节细胞和抗体介导的免疫反应,下调促炎细胞因子如巨噬细胞游走抑制因子、肿瘤坏死因子-2(tumor necrosis factor-alpha2，TNF2)及转化生长因子2(transforming growth factor beta 2，TGF2)的表达,减轻移植心的动脉硬

9、化及间质纤维化,延长大鼠移植心脏的存活时间。Braudeau 等16研究表明受者尾静脉注射HO-1 基因可使异位移植心脏长期存活,效果优于心肌内或后肢肌肉注射,明显抑制移植心脏炎症细胞浸润和实质细胞凋亡,减少移植物内多种细胞因子(如TGF2、TNF2、干扰素等)的表达。还有学者对HO-1基因分别在供、受体表达对于心脏急性排斥反应的抑制作用进行研究，发现受体过表达HO-1基因更甚于供体过表达对于同种心脏移植急性排斥反应的抑制作用17。研究表明诱导HO-1过表达可保护大鼠心脏抵御低温引起的IRI，在缺血再灌注的动物模型中，高表达HO-1的转基因鼠的梗塞面积为14.7%,远低于野生型的56.5%，且

10、心功能恢复较好18。3HO-1基因转染与血管移植器官移植后慢性排斥反应引起的移植物丢失成为影响患者长期存活的重要原因，而移植物动脉硬化是导致慢性排斥反应的基本病理改变，内皮细胞是供、受者细胞间最早接触的部位，也是最早被受者免疫系统所识别的供者细胞。已有研究表明，HO-1能有效保护内皮细胞和抑制移植物血管硬化的形成19。国内研究报道如果兔静脉移植前应用含人HO-1基因的重组腺病毒转染静脉移植血管，术后28 d其移植血管内膜厚度、内膜与中膜厚度比值均显著低于未转染组，提示HO-1基因转染可以抑制血管内膜的增生20。Bouche等21报道大鼠主动脉移植30 d后，将人HO-1cDNA转染移植的主动脉

11、后，主动脉内膜增生程度明显低于对照组， HO-1通过抑制白细胞的渗出和血管平滑肌细胞向内皮层的游走等作用，抑制慢性排斥反应。Chauveau等22的研究亦支持此观点。有研究在血管内皮细胞中稳定地转染HO-1基因，结果转染后T细胞对血管内皮细胞的黏附性显著下降，而且这种保护作用可以被HO-1的抑制剂-ZNPP逆转，表明HO-1可以减少淋巴细胞对血管内皮细胞的黏附23。4HO-1基因转染与肾脏移植Nath等24研究表明HO-1的表达是阻止肾小管间质炎症反应及炎症因子基因表达所必需的。用含有腺病毒为载体的HO-1保存液保存供体肾24 h后行同种异体肾移植，结果发现通过外源性HO-1基因导入促进HO-

12、1表达，可以降低供肾的缺血再灌注损伤，减轻肾小管水肿、延缓肾小球的硬化进程，并启动内源性的适应机制，减少机体炎症介质的释放，降低第二次打击带来的组织损伤等，明显提高术后存活率。Salahudeen等25研究结果与此类似，在供肾冷保存期间，通过转基因技术促进供肾组织HO-1基因表达，减轻细胞组织损伤，移植后可以提高受体的存活率。Hansen等26以重组腺病毒为载体，利用基因转移技术观察局部HO-1基因高表达对于肾移植IRI的细胞保护作用，发现HO-1基因在供肾的过表达可显著改善移植肾术后功能的恢复。5HO-1基因转染与胰岛细胞移植胰岛细胞移植后不仅极易遭受免疫细胞的攻击，而且移植部位局部的炎症反

13、应导致移植的胰岛细胞大量死亡。国外学者通过药物诱导的方法促进胰岛细胞内HO-1基因的表达，提高了胰岛细胞移植后的存活率27，国内学者采用腺病毒做载体将人HO-1基因转染SD大鼠胰岛细胞，体外培养7 d后，采用高糖(16.7 mmol/L)刺激,结果显示HO-1基因转染组胰岛素分泌浓度(12.52.17 mIU/L/IEQ)明显高于未转染组(9.630.71 mIU/L/IEQ)28。6HO-1基因转染与小肠移植Coito等29研究表明HO-1在小肠移植中的过度表达对细胞起保护作用，表现为中性粒细胞、T淋巴细胞等在移植器官中浸润减轻，炎症因子水平下降，局部微循环改善。在IRI 中， HO-1 通

14、过清除细胞内的血红素，使其降低到一定程度，抑制NAD(P)H氧化酶、COX-2的功能，从而抑制IRI 中超氧化阴离子(O2-)、前列腺素和NO 的合成，减轻IRI 的有害作用。另外，细胞外血红素能提高中性粒细胞活化时致炎症因子的分泌量，并能抑制中性粒细胞凋亡而维持其致炎症的活性。HO-1通过降低细胞外血红素的水平来抑制中性粒细胞活化以及致炎症细胞因子的产生，从而抑制IRI。肇毅等30的研究结果显示HO-1可能通过抗氧化损伤通路抑制细胞凋亡，从而减轻移植肠IRI。此外，HO-1的催化产物CO可以扩张血管、抑制血小板聚集、保持移植肠的微循环通畅，可能在减轻移植肠IRI中发挥一定的作用。但迄今未见有

15、关HO-1基因转染与小肠移植研究的报道。小肠移植较其他实质器官对IRI更敏感。多年来因其难以控制的排异反应，使小肠移植的临床应用远远落后于其他器官移植的研究和发展。HO-1基因转染能否为小肠移植的临床应用开拓新的局面，是目前广大科研人员和临床工作者关注的焦点。7HO-1基因在临床器官移植中的研究Takashi等31首次报道HO-1 在人体肝脏移植中的临床研究，6位肝移植患者术后接受肝活组织检查，HO-1基因主要在肝脏非实质细胞表达，而且术后HO-1阳性表达细胞的数量是移植术前的3倍，认为IRI是导致HO-1基因表达的主要原因。Lu等32学者则报道在肺移植患者术后HO-1活性升高与术后排斥反应和肺出血密切相关。目前有关HO-1基因转染在人体移植器官中作用的相关研究尚未见报道。利用转基因途径实现HO-1的稳定过表达已取得令人鼓舞的效果。它避免了在应用诱导剂诱导HO-1表达的同时诱导其他抗氧化酶如一氧化碳合酶、鸟苷酸环化酶等的表达。目前认为转基因治疗的局限之一是基因表达和蛋白的产生都是瞬间的，但考虑到器官移植时IRI是一次性事件，因此基因治疗所产生的瞬间免疫抑制分子足以阻碍效应细胞对免疫的调控33