细胞内钙在人胃癌细胞缺氧诱导因子1表达及转录激活中的作用

1、细胞内钙在人胃癌细胞缺氧诱导因子1表达及转录激活中的作用         08-06-10 11:34:00     编辑：studa20          作者：兰梅，时永全，韩者艺，宁晓喧，樊代明【摘要】  目的观察细胞内钙变化对氧调节性亚单位HIF1表达及其HIF1转录激活的影响。方法常氧时，采用通透性细胞内钙的螯合剂BAPTAAM或钙的离子载体Ionomycin降低或升

2、高细胞内钙，用Westernblot检测其对SGC7901细胞中HIF1蛋白表达的影响，然后采用间接免疫荧光法、双荧光素酶报告系统及ELISA法检测改变细胞内钙对HIF1转位、HIF1转录活性及其靶基因血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）分泌的影响。结果用BAPTAAM降低细胞内钙，能诱导HIF1的表达，促进HIF1的转位，增强HIF1的转录活性，增加HIF1调节基因VEGF的分泌。用Ionomycin升高细胞内钙，虽然也有微弱的促HIF1稳定及转位作用，但对HIF1转录活性及VEGF的分泌并无明显影响。结论螯合细胞内钙能诱导胃癌细

3、胞中HIF1的表达及HIF1的转录激活，提示细胞内钙变化可能在胃癌细胞的缺氧信号转导过程中发挥了重要作用。 【关键词】  胃癌细胞；细胞内钙; 缺氧诱导因子1; 蛋白表达；转录活性Department of Internal Medicine, the Affiliated Hospital of Medical College of Shaoxing University, Shaoxing 312000, China; Institute of Digestive Disease & State Key Laboratory of Cancer Biology, Xiji

4、ng Hospital, Fourth Military Medical UniversityAbstract：Objective To  study the possible roles of changed intracellular calcium level in SGC7901 cells on HIF1 expression and HIF1 transcriptional activity. MethodsUnder normoxic conditions, the protein expression of HIF1 in SGC7901 cells after tr

5、eatment with BAPTAAM (a cellpermeant Ca2+ chelator), or ionomycin (an calcium ionophore) was observed by Western blot. The effect of BAPTA or ionomycin on nuclear location of HIF1, HIF1 luciferase activity as well as secretion of vascular endothelial growth factor (VEGF), a typical HIF1 target gene,

6、 was determined by indirect immunofluorescence assay, dual luciferase reporter system and enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) respectively. ResultsDecreasing the intracellular calcium level by BAPTA induced HIF1 nuclear accumulation, stimulated HIF1dependent transcription and enhanced expressio

7、n of VEGF in SGC7901 cells under normoxic conditions. However, the induction of HIF1 activity and the secretion of VEGF were not caused by ionomycin application, though it can mediated a weak and transient HIF1 nuclear accumulation. ConclusionChelation of cellular calcium modulates HIF1 expression a

8、nd HIF1 transcriptional activity in human gastric cancer cells. Changes in intracellular free calcium concentration appeared to have a critical role in hypoxic signal transduction in gastric cancer cells.Key words：Gastric cancer cells;  Intracellular calcium;  HIF1;  Protein expressio

9、n;  Transcriptional activity0引言近来发现1缺氧可使内皮细胞中的Ca2+明显增加，升高或降低细胞内Ca2+，可增加或降低缺氧诱导基因如血管内皮生长因子(vascular  endothelial  growth factor, VEGF)等的表达，提示细胞内Ca2+与缺氧诱导基因的表达有关，可能在细胞的缺氧反应中发挥了重要作用。那么对于早期即可出现缺氧的实体瘤来说，作为重要第二信使的细胞内Ca2+是否也与其缺氧信号的调节有关、是否也能通过对HIF1的调节而影响肿瘤细胞的恶性表型呢？我们前期研究曾证实常氧时在人胃癌细胞SGC7901中即有

10、HIF1的表达2，为此，本研究主要观察改变细胞内钙对SGC7901细胞中HIF1表达及转录激活的影响，以期为胃癌缺氧信号转导机制的阐明奠定一定理论基础，为胃癌的诊治提供一定的思路。1材料和方法1.1材料胃癌细胞系SGC7901为第四军医大学西京医院消化疾病研究所保存； BAPTAAM购自BIOMOL公司； Ionomycin及actin的单抗为Sigma公司产品； HIF1多抗为Santa公司产品；  FuGENE6转染试剂购自Roche公司； 双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自Promega公司； VEGF检测试剂盒购自上海森雄公司； pGL3SV40HRE质粒（在BamH位点插入2

11、个拷贝的缺氧反应元件）为大阪大学医学院Mayuko Osada 教授惠赠。1.2方法1.2.1改变细胞内钙对HIF1蛋白稳定的影响Western blot法消化对数生长期的细胞，铺板，培养过夜；换无血清培养液，分别加入12.5M  BAPTAAM、1M   ionomycin孵育0、2、4、8、12、24h，收获细胞。三去污裂解细胞制备总蛋白，Bradford法测定蛋白浓度；取100g总蛋白上样，行SDSPAGE电泳，转膜，8%脱脂奶粉封闭2h，加HIF1多抗（稀释度1200）4孵育过夜，TBST漂洗10in×3后，加二抗室温孵育23h，洗膜3次，ECL

12、显影。1.2.2改变细胞内钙对HIF1转位的影响间接免疫荧光化学法胰酶消化并收获对数生长期的SGC7901细胞， 传代于装有载玻片的无菌培养皿中， 培养过夜； 换无血清培养液， 加入12.5M  BAPTA、 1M   ionomycin分别孵育0、 2、 4、 8h后， PBS冲洗3次， 95乙醇固定， 再次用PBS冲洗10min×3次后， 加0.3% Triton X100室温10min， 正常山羊血清37封闭10min， 加HIF1多抗（1100）4孵育过夜。 PBS溶液洗涤10min×3次， 加入1100的FITC标记的羊抗兔IgG，

13、37孵育2h。 PBS洗10min×3次， 荧光显微镜观察照相。1.2.3改变细胞内钙对HIF1转录活性的影响报告基因检测接种对数生长期的SGC7901细胞于48孔板(每孔设3个复孔)，常规培养至70%80%融合，按FuGENE 6转染试剂说明制备转染复合物加入48孔板(pGL3SV402HREpRLTK约101)，继续培养2436h；换用无血清RPMI1640，加入12.5M   BAPTAAM、1  M   Ionomycin，继续培养8h；吸去培养液，每孔加入80l被动裂解液，12000r/min离心10min，上清转至新的离心

14、管；取10l上清和荧光素酶检测试剂（Luciferase Assay Reagent，LAR）50 l混合，在TD20/20荧光发光计第一次检测萤火虫荧光素酶活性，然后加入50 l Stop & GloTM试剂，混合后第二次检测海肾荧光素酶活性；所有萤火虫荧光素酶活性用海肾荧光素酶活性正态化，所有的实验数据取3个样品平均值，每个实验重复2次。1.2.4改变细胞内钙对VEGF分泌的影响ELISA将对数生长期的SGC7901细胞接种于24孔板，每孔设3个复孔；细胞生长至70%80融合时，换用无血清培养液，分别加入12.5M  BAPTA、1M   Ionomycin继续培养16h；计数细胞，2000r/min离心、无菌收集细胞培养上清，按ELISA试剂盒说明检测VEGF蛋白含量。1.3统计学处理采用SPSS10.0软件处理数据，多组均数间的两两比较采用O