高功率微波对视网膜神经节细胞脂质过氧化作用的实验研究

1、高功率微波对视网膜神经节细胞脂质过氧化作用的实验研究摘要：目的观察微波对体外培养的兔视网膜神经节细胞的脂质过氧化损伤作用。方法体外培养兔神经节细胞，以平均功率为80mW/cm2的微波进行辐照，辐照时间分别为15、30、45min。辐照后立即于倒置显微镜和电镜下观察细胞形态变化，羟胺法和改良硫代巴比妥酸荧光法分别测定细胞内超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量。结果微波辐照后，细胞轴突消失，电镜可见线粒体及内质网肿胀。随辐照时间延长，细胞逐渐趋向于坏死，细胞MDA含量增高，45min辐照组MDA含量为对照组的5.1

2、1倍。SOD则逐渐降低。结论微波可引起视网膜神经节细胞脂质过氧化损伤，脂质过氧化反应可能是微波视网膜损伤的作用机制之一。关键词：微波/副作用；视网膜神经节细胞病理学；脂质过氧化作用分类号：R774R538.9文献标识码：A文章编号：1005-1015（2000）01-0032-03Study of lipid peroxide damage in retinal ganglion cells induced by high power microwaveYANG RuihuaCHEN JingyuanHUANG Wenhua（Department of Military Hygiene,the

3、 Fourth Military Medical University,Xian 710032，China）Abstract：ObjectiveTo determine the lipid peroxide damage in the primary cultured rabbit retinal ganglion cells induced by microwaveMethodsCultured rabbit retinal ganglion cells in vitro and exposed to 80 mW/cm2 of microwave for 15,30,45 min tespe

4、ctivelyImmediately after radiation,the morphological variation of cells was observed by optical microscope and transmission electronic microscopeSecondly,the activity of intracellular superoxide dismutase (SOD) and the content of malondialdehyde (MDA) were detectedResultsA portion of cells congregat

5、ed,with their axon disapeared after radiationMitochondria and endoplasmic reticulum revealed swelling under transmission electronic microscopeThe content of MDA was increased obviously compared with control group while SOD decreasedThe content of MDA as increased obviously compared with control grou

6、p after 45 min radiation was 511 times,while SOD decreasedThe content of MDA as in control and the ganglion cells were apparantly destroyedConclusionMicrowave can induce the lipid peroxide damage in primary cultured retinal ganglion cells,and lipid peroxide effect might be one of the mechanisms of m

7、icrowave retinal damageKey Words：Microwaveadvevse effects；Retinal ganglion cellspathology；Lipid peroxidation研究表明，微波可对眼造成明显损害1-3，导致白内障，损伤角膜、虹膜等，微波对视网膜损伤的研究较少。为此，我们观察了微波对体外培养的兔视网膜神经节细胞的脂质过氧化损伤，以便为进一步研究微波的眼底损伤及防护提供一定的实验依据。1材料和方法细胞培养：家兔由本校中心实验室提供，6只，黑色或灰色，雄性，体重(1.80.68)kg。静脉气栓处死家兔，取出眼球，剔除周围软组织，75%酒精浸洗，沿

8、眼球赤道环形剪开巩膜，由切口处向视盘剥取视网膜，至视盘处剥离，0.25%胰酶消化，含10%小牛血清的改良依格培养液(Dulbecco?s modified Eagle?s medium,DMEM)终止消化，1000r/min离心5min后弃上清，D-Hank?s液洗涤(1000转，5min)2次，接种于含10%小牛血清的DMEM培养液中，37、5%CO2孵箱培养。细胞辐照：速调管微波源，频率2.856109 Hz，脉冲波，脉宽2s，平均功率80 mW/cm2，培养72h的细胞，培养瓶细胞生长面面向波源，于屏蔽室内进行辐照。辐照时间分别为0、10、30、45min。室温19?20。观测内容：细胞

9、形态观察：辐照后立即于光镜下观察细胞，以胰酶消化收集细胞，0.3%戊二醛固定后进行电镜观察。超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)测定：胰酶消化收集细胞，平衡盐溶液漂洗2次，调整细胞数为1106/ml，超声粉碎，取100l细胞粉碎液分别用羟胺法4和改良硫代巴比妥酸荧光法5测定SOD和MDA。统计学处理：用SPSS统计软件进行t检验。2结果细胞鉴定：细胞培养35d后，细胞贴壁，可见到细胞有轴突伸展(1)。抗神经元烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)免疫组织化学染色阳性，确认为神经节细胞。1正常RGCs光镜像。细胞较小，可见轴突伸展活细胞250Fig1Normal

10、 RGCs under optical microscopeRGCs were small,axons can be seen250微波辐照对视网膜神经节细胞形态的影响：微波辐照后，15min组细胞轴突消失(2)，电镜下可见细胞线粒体肿胀，嵴减少(3)，30min组细胞发生聚集，边缘模糊，电镜观察可见凋亡细胞(4)，60 min组部分细胞脱壁，可见细胞碎片，细胞数量明显减少。2微波辐照15min后RGCs光镜像。RGCs轴突消失活细胞250Fig2Configuration of RGCs after 15 min microwave radiation in optical microsco

11、peAxons of RGCs dispeared2503微波辐照15min后RGCs电镜像。电镜下可见细胞线粒体和内质网肿胀醋酸铅-枸橼酸铅双染色5000Fig3Configuration of RGCs after 15 min microwave radiation detected bytransmission electronic microscopeMitochondria and endoplasmic reticulum looked swellingAceticleadandcitricleaddyeing50004微波辐照30min后RGCs电镜像。RGCs染色质浓缩，边集

12、为凋亡细胞醋酸铅-枸橼酸铅双染色5000Fig4Configuration of RGCs after 30 min microwave radiation detected by transmission electronic microscopeThe apoptosis RGCs chromosome collected and encircled on cell nuclear membrane5000微波辐照对视网膜神经节细胞SOD与MDA含量的影响：微波辐照后，MDA显著升高，且升高辐度与辐照时间成正相关；SOD活性则随辐照时间延长而逐步下降(表1)。表1不同时间微波辐照后视网膜神

13、经节细胞SOD、MDA含量(s,n=6)Tab1Content of SOD and MDA of retinal ganglion cellsafter microwave radiation (s,n=6)MDA(mol)SOD(U)control group48025510201610 min182808072005*30 min1843252*058001*45 min2455219*054003*t-test*P005,*P001 vs control group 3讨论微波对眼损伤主要涉及晶状体、视网膜和角膜，目前研究较多的是对晶状体的损伤，而有关视网膜损伤的报道较少，且多为组织病

14、理学损伤的观察1，2。本实验以兔视网膜神经节细胞为对象研究高功率微波辐照的损伤作用，结果表明：脉冲波辐照可导致体外培养的兔视网膜神经节细胞发生形态学变化，首先表现为轴突的破坏，细胞发生聚集，随辐照时间的延长，细胞形态进一步遭到破坏，60min后已不能观察到完整的细胞形态。有关微波对视网膜损伤的机制多认为是由于微波的热效应引起6。本实验中各组温度无明显变化，但SOD与MDA已明显改变。可见，微波除了热效应外，可能还具有非热效应，通过脂质过氧化引发细胞损伤。视网膜的光感受器外段含大量长链不饱和脂肪酸，受到过氧化作用后形成脂质自由基，并攻击其他不饱和脂肪酸引起连锁反应。在微波作用下，核膜、盘膜、线粒

15、体膜和内质网的脂质发生过氧化，导致膜中蛋白质酶和磷脂交联失活，使膜的流动性和通透性改变而受到不可逆的损伤，严重者导致生物膜溶解和细胞死亡。MDA是脂质过氧化反应的主要降解产物，可作为体内自由基水平的间接反映指标，MDA含量随辐照时间延长而增高说明微波对神经节细胞的损伤涉及脂质过氧化反应，同时清除超氧阴离子自由基的SOD随辐照时间延长而逐渐下降，与MDA的变化相对应，说明辐照时间越长，脂质过氧化损伤越严重。(本文编辑：唐健)作者单位：杨瑞华（710032 西安，第四军医大学军队卫生学教研室）陈景元（710032 西安，第四军医大学军队卫生学教研室）刘学东（710032 西安，第四军医大学军队卫生

16、学教研室）邓中荣（710032 西安，第四军医大学军队卫生学教研室）刘秀红（710032 西安，第四军医大学军队卫生学教研室）龚书明（710032 西安，第四军医大学军队卫生学教研室）黄文华（西北核技术研究所）刘国治（西北核技术研究所）参考文献：1刘导涪，楼苏生微波辐射及其对眼的影响J眼外伤职业眼病杂志1984，2：123-128.2Paulsson LERetinal damage experimentally induced by microwave radiation at 55 mW/cm2JActaOphthalmol,1979,57:183-1853Bhatt N,Peyman GA,Khoobehi B,et alMicrowave induce