从动物血液中提取基因组DNA方法的比较研究

1、第28卷第4期2005年12月辽宁师范大学学报(自然科学版Journal of Liaoning Normal University(Natural Science EditionVol.28No.4Dec.2005文章编号:100021735(20050420457204从动物血液中提取基因组DNA方法的比较研究逄洪波1,2,陈永燕1,张恒庆2,周其兴1(1.大连大学生物工程学院,辽宁大连116622;2.辽宁师范大学生命科学学院,辽宁大连116029摘要:从血液中提取基因组DNA的传统方法是先得到淋巴细胞,再用蛋白酶K、SDS消化,然后用酚、氯仿抽提,乙醇沉淀.CTAB法提取基因组DNA多

2、应用于植物和微生物,从全血中提取基因组DNA报道甚少.采用改良的CTAB法从全血中提取基因组DNA,并以传统方法和TA KARA Blood Genome DNA Extraction K it作对照.结果表明:CTAB法可以得到大量的、较完整的基因组DNA,并且纯度达到1.82.0,可以满足PCR扩增和限制酶切等实验的要求.关键词:血液;CTAB法;DNA提取;PCR分析中图分类号:R3文献标识码:A获得基因组DNA是进行后续分子生物学研究的基础,寻找合适的DNA提取方法是开展大多数分子生物学实验所面临的第一个问题.从血液中提取基因组DNA的方法大都是先得到淋巴细胞,再用蛋白酶K、十二烷基硫

3、酸钠(SDS消化,然后用酚、氯仿抽提,乙醇沉淀.该种方法的不足之处在于程序繁琐、耗时,而且蛋白酶K也比较昂贵.C TAB裂解提取法常用于新鲜植物组织的DNA提取.近年来, CTAB法也逐步应用于动植物标本和化石DNA的提取1.刘波等2用CTAB法分别对稻蝗(Oxya的干标本和酒精浸泡标本的DNA进行提取并获得了满意结果.Yang等3用3种方法提取了Proboscide2 an的化石和馆藏标本的DNA,也认为用C TAB法提取化石DNA的成功率最高.但是用C TAB方法从动物全血中提取基因组DNA报道甚少.本研究的目的在于寻找一种可以获得高质量,但耗费时间少、程序简单、节约药品的血液DNA提取方

4、法.1材料和方法采集新鲜的家兔全血(静脉血4,5,加入抗凝剂柠檬酸钠(ACD6,选用3种不同方法从全血中提取基因组DNA,并经琼脂糖凝胶电泳、紫外吸收光谱和PCR扩增来检测提取的DNA的纯度和浓度7.1.1血液标本的采集对同一只健康家兔进行耳缘静脉取血,分装成每管0.5mL,冻存于-20.1.2D NA提取1.2.1试剂4×C TAB提取液(0.1M Tris2HCl(p H8.0,0.5M NaCl,0.5M ED TA,4g C TAB,1g PV P;氯仿2异戊醇(241;异丙醇;抗凝剂ACD8;磷酸盐缓冲液(PBS8;抽提缓冲液8;蛋白酶K; Tris饱和酚等.1.2.2仪器

5、台式冷冻离心机(Biof uge primo R15000rad/min;紫外透射分析仪(STS型,上海长明光学电子仪器厂;稳压稳流电泳仪(D YY2型,北京六一仪器厂;紫外分光光度计(日本分光株式J asco公司,V560型.1.2.3方法改良C TAB法采用4×CTAB(Doyle&Doyle,1987法并做适当的修改,具体步骤如下:在装有血液的2mL离心管中加入500L预热的4×CTAB提取液和2L2巯基乙醇,使材料完全分收稿日期:2005207211基金项目:国家自然科学基金资助项目(30300021作者简介:逄洪波(19802,女,辽宁盖州人

6、,辽宁师范大学硕士研究生.周其兴(19712,男,四川资中人,大连大学副教授,博士.E2mail:dlzhqx.458辽宁师范大学学报(自然科学版第28卷散在提取液中,65温浴约1.5h.待冷却至室温后加入等体积的氯仿2异戊醇(241,上下颠倒离心管,温和混匀5min 后离心5min (1000rad/min .将上清液转管,反复抽提3次.最后一次离心10min.吸取上清液,加入70%体积的异丙醇,沉降DNA ,轻轻颠倒23次,可见白色絮状沉淀,室温下静置30min 以上,然后10000rad/min 离心7min ,弃上清.用200L 70%的乙醇和无水乙醇各洗2次,每次离心2min 后弃上

7、清,然后将离心管放在37烘箱中(或室温下使乙醇挥发.待总DNA 干燥后加50L TE 溶液和1.5L RNase 于37水浴中温浴2h ,然后于-20(或4冰箱中保存备用.传统方法提取DNA 按照分子克隆实验指南进行8.该法由Blin 和Stafford (1976根据Gross 2Bellard 等(1973的方法改进而成.TA KA RA 试剂盒提取基因组DNA 按照说明书上的步骤严格进行,每管血液提取的DNA 最后溶于50L TE 中.1.3浓度和纯度的检测1.3.1琼脂糖凝胶电泳采用稳压稳流电泳仪(D YY -2型和STS 型紫外透射分析仪.其中琼脂糖的浓度

8、为0.8%,电压为100V ,电泳时间为40min.1.3.2紫外分光光度计检测采用日本分光株式J asco 公司(V -560型的紫外分光光度计分别测定这3种方法提取的基因组DNA 在260、280nm 处的吸收值,绘制光吸收值曲线.并根据OD 260/OD 280计算其纯度9,10.产量计算公式为dsDNA =50×OD 260×稀释的倍数.1.3.3PCR 扩增比较不同的模板DNA 扩增兔线粒体D 2loop 区A1片段11,引物1和引物2是由宝生物(大连工程有限公司合成.引物152CTTT AAT AAAACTCAA GT AC 23;引物2:52CTCGTCT A

9、 2CAAT AA GTGTC 23,扩增片段近700bp.扩增反应在Thermo Hybaid PCR 仪上进行.PCR 的反应体系为25L.内含2.5L 10×PCR buffer (500mmol/L KCl ,100mmol/L T ris ,15mmol/L MgCl 2,p H8.8,1.25L dN TP (2.5mmol/L ,1.25L 引物1(5pmol/L ,1.25L 引物2(5pmol/L ,0.25L Ex T ag 酶(5,1L 模板DNA ,加无菌双蒸水至25L.反应程序:94预变性5min ;循环周期依次为94变性45s ,55退火45s ,72延伸

10、1min ;35次循环后,72延伸10min ,结束.为验证PCR 的可重复性和一致性,用同样的反应体系和程序重复3次,至结果稳定.2结果与分析图1全血基因组DNA 琼脂糖凝胶电泳图片1,2,3为传统方法提取的DNA ;4,5,6为CTAB 法提取的DNA ;7,8,9为试剂盒提取的DNA ;两侧为Marker ,左侧的为dl2000,右侧的为DNA/Hind .以后图中出现代码含义相同.2.1D NA 的检测2.1.1琼脂糖凝胶电泳结果观察3种方法提取的DNA 电泳图谱可以发现(见图1,3种方法均可以从全血中得到基因组DNA ,其中以TA KARA 试剂盒提取的DNA 条带最弱,量最少;而传

11、统方法和C TAB 法提取的DNA 都呈明亮均一的条带,没有显著差别.3种方法提取的DNA 都没有拖尾现象,说明提取的DNA 没有发生降解.2.1.2紫外吸收光谱测定结果(见附表结果表明,用CT AB 法提取的DNA 在260nm 处均呈吸收高峰,说明CT AB 法提取的DNA 较纯.而用另外两种方法所提DNA 的曲线没有明显的吸收峰,说明含有大量杂质.这与测得的数值一致,3种方法得到的DNA 纯度的平均值分别为1.12、1.92和1.04(见图24,其中传统方法和试剂盒法提取的DNA 纯度较低,说明蛋白质和酚去除的不完全.此外在浓度上,也以CT AB 法从抗凝血中提取的DNA 最大,为14.

12、48g/mL.其次为传统方法,为6.47g/mL.T A KARA 试剂盒法提取的DNA 最小,只有3.89g/mL.2.1.3PCR 扩增结果将所有样品的DNA 模板稀释至同一浓度,进行PCR 体外扩增,扩增结果如图5.从图片中可以看出,在普通PCR 条件下,用CTAB 法提取的DNA 均出现均一、明亮的目的条带,特异性明显;TA KA RA 提取的DNA 样品只出现了很微弱的目的条带;而传统方法没有出现任何条带.第4期逄洪波等:从动物血液中提取基因组DNA 方法的比较研究459附表3种方法从抗凝血中提取的基因组DNA 纯度和产量的比较样品OD 260OD 280纯度OD 260/OD 28

13、0产量/(g/mL 传统方法A0.20060.1841 1.09 6.69传统方法B0.19430.1729 1.12 6.48传统方法C0.18680.1713 1.09 6.23CTAB 法A0.44500.2344 1.9014.83CTAB 法B0.36210.1731 2.0912.07CTAB 法C 0.49620.2809 1.7716.54试剂盒法A 0.11600.1130 1.03 3.87试剂盒法B 0.12370.1191 1.04 4.12试剂盒法C0.11080.1056 1.05 3.69大多数的PCR 对模板要求不高,可以是粗制品,但是不能混有蛋白酶、核酸酶、T

14、aq DNA 聚合酶抑止剂以及能与DNA 发生结合的蛋白,这在DNA 的提取中应该尽量避免12.传统方法之所以没有出现目的条带,究其根本原因,可能是存在较多的抑制剂,导致没有产生能检测到的PCR 产物.K osel &Graeber (1994和Diaz 2Cano &Brady (1997通过实验证明,蛋白酶K 的用量与最终的DNA 得率成正比.这也与传统方法提取DNA 的得率稍高相符合.传统方法虽然DNA 得率稍高,但操作烦琐、耗时,效果较差;而TA KA RA 的试剂盒虽然可以扩增,但是目的片段量很少,明显逊色于CTAB 法.另外由于PCR 技术十分灵敏,在本研究过程中设

15、置阴性对照(无菌水并贯穿于研究过程的始终.从图5中可以看出,无菌水作为样品没有出现任何条带,说明过程中没有任何外源DNA 的污染,保证了结果的可信度. 图2传统方法提取DNA的光吸收值曲线图3CTAB 法提取的基因组DNA的光吸收值曲线 图4试剂盒法提取的基因组DNA 光吸收值曲线图5兔线粒体D 2loop 区扩增结果.3结论综上所述,本实验中采用改进的C TAB 法提取的基因组DNA 纯度、浓度、完整性均能满足绝大部分分子生物学实验的要求,是本文3种方法中效果最好的一种.并且该方法不需要贵重仪器,操作相对简单,适用于各类实验室.因此,笔者认为通过本实验,找到了一种方法简便、经济、效率高的血液

16、基因组DNA 提取方法CTAB 法.辽宁师范大学学报(自然科学版第28卷460参考文献:1庞俊峰,张亚平.标本DNA研究进展J.动物学研究,2001,22(6:4902496.2刘波,郑哲民,张迎春,等.稻蝗属基因组DNA提取方法J.陕西师范大学学报(自然科学版,1997,27(3:97299.3YAN G,GOL ENBER G E M,SHOSHANI J.Proboscidean DNA from museum and fossil specimens:an assessement of ancientDNA extraction and amplification techniques

17、J.Biochem Genet,1997,35(526:1652179.4范海荣,夏永静,孙福成.四种全血基因组DNA提取方法的比较J.中国动脉硬化杂志,2002,10(6:5352536.5韩喜荣,胡永华.血液标本类型及保存方式对DNA产量、质量的影响J.中国卫生检验杂志,2002,12(5:5402542.6韩志芳.抗凝剂在实验中合理选择和应用J.医学理论和实践,2002,15(4:3782379.7王存芳,苑存忠.长期直接冻存猪肉样中基因组DNA提取方法的改进与PCR分析J.河南农业科学,2003(2:43246.8萨姆布鲁克J,弗里奇E F,曼尼阿蒂斯T.分子克隆实验指南M.第2版.金

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20、Science,Liaoning Normal University,Dalian116029,ChinaAbstract:Traditional met hods of ext racting geno mic DNA f rom animal blood are as follows.Getting hold of lymp hocyte firstly,t hen digesting it by p roteinase K and SDS,ext racting by hydroxybenzene and chloroform,depo siting by alcohol finally.The met hod of C TAB,which is extensively applied t