第五章蛋白质工程ppt课件

1、蛋白质工程与食品产业内容n一、蛋白质的功能与结构一、蛋白质的功能与结构n二、蛋白质工程的诞生二、蛋白质工程的诞生n三、蛋白质工程的基本步骤和改造方法三、蛋白质工程的基本步骤和改造方法n四、蛋白质工程在食品产业中的应用四、蛋白质工程在食品产业中的应用一、蛋白质的功能与结构n1.1蛋白质的功能蛋白质的功能n1.2蛋白质的结构蛋白质的结构1.1蛋白质的功能n(1)蛋白质是构成生命的重要物质之一n 蛋白质是一类重要而复杂的生物大分子，它广泛地存在于所有生物界的机体之中，具有许多重要的作用：n 构成生物体新陈代谢的几乎全部的化学反应都是在活性蛋白质-酶的催化下进行的；n 高等动物的免疫反应，也主要是通过

2、蛋白质即抗原和抗体来完成的；n 运动时的肌肉收缩靠的是某些蛋白质的相互作用来完成的；n 运输氧和二氧化碳的是血红蛋白；n 具有代谢和调节功能的是多种蛋白质激素。n(2) (2) 蛋白质的应用蛋白质的应用n 蛋白质是人类赖以维持生命的重要营养来源之蛋白质是人类赖以维持生命的重要营养来源之一。人们需要从各种肉、蛋、奶、豆类等主要食品一。人们需要从各种肉、蛋、奶、豆类等主要食品中获得所需的蛋白质营养。中获得所需的蛋白质营养。n 用蛋白质诊断和治疗某些疾病。淀粉酶、脂肪用蛋白质诊断和治疗某些疾病。淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶用于帮助消化，治疗某些消化不良性疾酶、蛋白酶用于帮助消化，治疗某些消化不良性疾病；胰

3、岛素用于治疗严重的糖尿病；转氨酶作为肝病；胰岛素用于治疗严重的糖尿病；转氨酶作为肝病变的指标等。病变的指标等。n 食品工业和轻工业中主要应用蛋白质或利用蛋食品工业和轻工业中主要应用蛋白质或利用蛋白质的性质制造各种产品。例如，酿造业要用蛋白白质的性质制造各种产品。例如，酿造业要用蛋白酶来增加酱油的鲜味等。用于人类衣着的羊毛、纺酶来增加酱油的鲜味等。用于人类衣着的羊毛、纺织品和皮革主要组成是蛋白质。织品和皮革主要组成是蛋白质。1.2蛋白质的结构n氨基酸是蛋白质的基本结构单位，各种氨基酸之间通过氨基酸是蛋白质的基本结构单位，各种氨基酸之间通过肽键彼此按直线形头尾相连，构成不同长短的肽链。肽键彼此按直

4、线形头尾相连，构成不同长短的肽链。肽键的形成n肽链又以一定方式折叠盘绕成独特的空间结构，这时才产生具有肽链又以一定方式折叠盘绕成独特的空间结构，这时才产生具有生物活性的天然蛋白质。生物活性的天然蛋白质。n多肽链的折叠可分为四种不同层次的结构。一级结构：仅指肽链多肽链的折叠可分为四种不同层次的结构。一级结构：仅指肽链中的氨基酸线型排列顺序，不考虑空间的排列。中的氨基酸线型排列顺序，不考虑空间的排列。牛胰岛素的氨基酸序列n二级结构：主链原子的局部空间排二级结构：主链原子的局部空间排列，不包括侧链构象和与其他链段列，不包括侧链构象和与其他链段的相互关系，如的相互关系，如- -螺旋、螺旋、- -折叠折

5、叠等主链构象单元就是二级结构。等主链构象单元就是二级结构。-螺旋三级结构：蛋白质的多肽链在各种二级结构的基础上再三级结构：蛋白质的多肽链在各种二级结构的基础上再进一步盘曲或折叠形成具有一定规律的三维空间结构。进一步盘曲或折叠形成具有一定规律的三维空间结构。碳酸酐酶的多肽骨架示意图n四级结构：具有二条或二条以上独立三级结构的多肽四级结构：具有二条或二条以上独立三级结构的多肽链组成的蛋白质，其多肽链间通过次级键相互组合而链组成的蛋白质，其多肽链间通过次级键相互组合而形成的空间结构。其中，每个具有独立三级结构的多形成的空间结构。其中，每个具有独立三级结构的多肽链单位称为亚基。四级结构实际上是指亚基的

6、立体肽链单位称为亚基。四级结构实际上是指亚基的立体排布、相互作用及接触部位的布局。如血红蛋白分子排布、相互作用及接触部位的布局。如血红蛋白分子中四个亚基之间的空间关系。中四个亚基之间的空间关系。血红蛋白的结构内容n一、蛋白质的功能与结构一、蛋白质的功能与结构n二、蛋白质工程的诞生二、蛋白质工程的诞生n三、蛋白质工程的基本步骤和改造方法三、蛋白质工程的基本步骤和改造方法n四、蛋白质工程在食品产业中的应用四、蛋白质工程在食品产业中的应用二、蛋白质工程的诞生n蛋白质工程是指基于蛋白质结构功能的蛋白质工程是指基于蛋白质结构功能的研究结果，通过基因工程技术，改造现研究结果，通过基因工程技术，改造现有蛋白

7、质和设计制造新蛋白质，因而也有蛋白质和设计制造新蛋白质，因而也称为第二代基因工程。称为第二代基因工程。n美国斯坦福大学的美国斯坦福大学的Charles YanofskyCharles Yanofsky教授，在教授，在19871987年的美国微年的美国微生物学会的年会上说，生物理论和技术在下列九方面的发生物学会的年会上说，生物理论和技术在下列九方面的发展促进了蛋白质工程的诞生。新的克隆技术，特别是完展促进了蛋白质工程的诞生。新的克隆技术，特别是完整的整的cDNAcDNA的克隆技术；快速测定的克隆技术；快速测定DNADNA序列的方法；序列的方法；从从DNADNA序列推算蛋白质序列的较好的计算机程序

8、系统；序列推算蛋白质序列的较好的计算机程序系统；蛋白质序列数据库的建立，使一级结构相似的蛋白质能被蛋白质序列数据库的建立，使一级结构相似的蛋白质能被很快地鉴定出来，并由此研究其功能上的相似性；对原很快地鉴定出来，并由此研究其功能上的相似性；对原核生物和真核生物基因表达调控的进一步深入了解；用核生物和真核生物基因表达调控的进一步深入了解；用于基因体外诱变的化学、酶学和合成技术的进展；于基因体外诱变的化学、酶学和合成技术的进展；X-X-光光晶体学的进展，包括较好的长晶体策略、同步辐射的应用晶体学的进展，包括较好的长晶体策略、同步辐射的应用、电子区域检测器的出现，以及计算机辅助的数据分析；、电子区域

9、检测器的出现，以及计算机辅助的数据分析；用计算机图像系统为工具直接观察晶体数据；核磁共用计算机图像系统为工具直接观察晶体数据；核磁共振技术的改进，使溶液中的原子分布能得到直接检测。振技术的改进，使溶液中的原子分布能得到直接检测。内容n一、蛋白质的功能与结构一、蛋白质的功能与结构n二、蛋白质工程的诞生二、蛋白质工程的诞生n三、蛋白质工程的基本步骤和改造方法三、蛋白质工程的基本步骤和改造方法n四、蛋白质工程在食品产业中的应用四、蛋白质工程在食品产业中的应用三、蛋白质工程的基本步骤和改造方法n3.1 蛋白质工程研究的基本步骤蛋白质工程研究的基本步骤n3.2 蛋白质改造方法蛋白质改造方法3.1 蛋白质

10、工程研究的基本步骤n分离纯化目的蛋白，使之结晶并作分离纯化目的蛋白，使之结晶并作X X晶体衍射分析，结晶体衍射分析，结合核磁共振等其他方法的分析结果，得到其空间结构合核磁共振等其他方法的分析结果，得到其空间结构的尽可能多的信息。的尽可能多的信息。n对目的蛋白的功能作详尽的研究，确定它的功能域。对目的蛋白的功能作详尽的研究，确定它的功能域。n通过对蛋白质的一级结构、空间结构和功能之间的相通过对蛋白质的一级结构、空间结构和功能之间的相互关系的分析，找出关键的基团和结构。互关系的分析，找出关键的基团和结构。n在蛋白质结构与功能研究的基础上，借助于计算机图在蛋白质结构与功能研究的基础上，借助于计算机图

11、像显示和分子辅助设计，提出对目的蛋白分子的改建像显示和分子辅助设计，提出对目的蛋白分子的改建或构建方案，并用基因工程的方法去实施。或构建方案，并用基因工程的方法去实施。n对经过改造的蛋白质进行功能性测定，看看改造的效对经过改造的蛋白质进行功能性测定，看看改造的效果如何。果如何。蛋白质工程的程序3.2 蛋白质改造方法n3.2.1 天然蛋白质的改造n3.2.1.1 基因的定向诱变技术n3.2.1.2 结构域的拼接 3.2.1.1 基因的定向诱变技术n普通，含有单一或少数几个突变位点的普通，含有单一或少数几个突变位点的基因定向改变可以采用基因定向改变可以采用M13-DNAM13-DNA寡聚核寡聚核苷

12、酸介导诱变技术、寡核苷酸介导的苷酸介导诱变技术、寡核苷酸介导的PCRPCR诱变技术、随机诱变技术和盒式突诱变技术、随机诱变技术和盒式突变技术。变技术。（1M13-DNA寡聚核苷酸介导诱变技术.将要改造的蛋白质的目的基因插入到M13单链DNA中作为模板，以含有要改变的碱基的一段寡聚作为模板，以含有要改变的碱基的一段寡聚核苷酸作为引物，在体外用核苷酸作为引物，在体外用DNADNA聚合酶进行聚合酶进行双链双链DNADNA的合成，用的合成，用DNADNA连接酶连接成环连接酶连接成环状状将杂合将杂合DNADNA双链再转入大肠杆菌中双链再转入大肠杆菌中将含突变目的基因的将含突变目的基因的M13M13噬菌体

13、筛选出来，噬菌体筛选出来，提取它们的提取它们的DNADNA，用限制性内切酶把突变目，用限制性内切酶把突变目的基因切下，并重组到表达质粒中的基因切下，并重组到表达质粒中（2寡核苷酸介导的PCR诱变技术将目的基因克隆到质粒载体上设计两对引物由于两个反应物中引物的位置不同，PCR扩增后，产物有不同的末端将两管PCR产物混合、变性、复性、退火，形成有两个切口的环状DNA，转入大肠杆菌。（3随机诱变技术将待突变基因克隆到质粒上，使基因旁有两个特殊的限制性酶切位点用大肠杆菌核酸外切酶EIII从3-凹陷端降解DNA用修复后的质粒转化大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段是完整的DNA聚合酶的一个片段

14、，只有在53聚合酶活性和35外切酶活性，失去了53外切酶活性反应一段时间后终止反应，再用Klenow片段补平（4盒式突变技术在目标基因中选择合适的限制性内切酶位点用含有突变序列的DNA片段来置换目标基因上的一段DNA序列产生突变序列被集中在目标基因的一个特定区域的突变家族产生突变序列被集中在目标基因的一个特定区域的突变家族n进行盒式突变，需要解决两个关键问题：进行盒式突变，需要解决两个关键问题：n 一个是在目标基因序列中，要有适当的限制性内切一个是在目标基因序列中，要有适当的限制性内切酶识别位点，使得用以取代天然酶识别位点，使得用以取代天然DNADNA序列的盒式突变序列的盒式突变序列可以有效地

15、插入到目标基因中。序列可以有效地插入到目标基因中。n 另一个是，如何得到各种合适的、用以取代目标基另一个是，如何得到各种合适的、用以取代目标基因中特定因中特定DNADNA片段的突变片段的突变DNADNA片段。值得注意的是，片段。值得注意的是，突变序列的两端必须分别具有与目标基因上相匹配的突变序列的两端必须分别具有与目标基因上相匹配的的限制性内切酶识别位点。的限制性内切酶识别位点。n盒式突变技术的实际应用：盒式突变技术的实际应用：n 加酶洗衣粉是人们日常生活中常用的东西，在洗衣加酶洗衣粉是人们日常生活中常用的东西，在洗衣粉中常加入的酶是枯草杆菌蛋白酶。枯草杆菌蛋白酶粉中常加入的酶是枯草杆菌蛋白酶

16、。枯草杆菌蛋白酶有一个弱点，一遇到漂白剂，就会被破坏而失去活性有一个弱点，一遇到漂白剂，就会被破坏而失去活性。枯草杆菌酶氧化失活的原因是由于第。枯草杆菌酶氧化失活的原因是由于第222222位的甲硫氨位的甲硫氨酸的被氧化造成的，但还不知道哪一种氨基酸替换甲酸的被氧化造成的，但还不知道哪一种氨基酸替换甲硫氨酸能维持酶的活性，并同时使它具有抗氧化的特硫氨酸能维持酶的活性，并同时使它具有抗氧化的特性。使用盒式突变技术，性。使用盒式突变技术，19851985年发现只有半光氨酸取年发现只有半光氨酸取代的突变酶活力比原酶提高代的突变酶活力比原酶提高138%138%，并可在过氧化氢，并可在过氧化氢一种氧化剂存

17、在小时不丢失酶活力。这样就制成一种氧化剂存在小时不丢失酶活力。这样就制成了合乎需要的漂白加酶洗衣粉了。了合乎需要的漂白加酶洗衣粉了。3.2.1.2 结构域的拼接n结构域是蛋白质构象中二级结构与三级结构之间的一个层次。在较大的蛋白质分子中，由于多肽链上相邻的超二级结构紧密联系，形成二个或多个在空间上可以明显区别它与蛋白质亚基结构的区别。n结构域拼接是通过基因操作把位于两种不同蛋白质上的几个结构域连接在一起，形成融合蛋白，它兼有原来两种蛋白的性质。n金属硫蛋白是一类小分子量的球蛋白，哺乳动物中的金属金属硫蛋白是一类小分子量的球蛋白，哺乳动物中的金属硫蛋白分子由硫蛋白分子由6161个氨基酸残基组成，

18、分为两个结构域，分个氨基酸残基组成，分为两个结构域，分别叫别叫 结构域和结构域和 结构域。结构域。 结构域能结合结构域能结合4 4个金属离子，趋个金属离子，趋向于与镉和汞结合；而向于与镉和汞结合；而 结构域能结合结构域能结合3 3个金属离子，趋向个金属离子，趋向于与锌和铜结合。实验表明，于与锌和铜结合。实验表明， 结构域结合镉的能力比结构域结合镉的能力比 结结构域高出构域高出10001000倍以上。倍以上。n用计算机分子模型软件对金属硫蛋白的空间结构进行分析用计算机分子模型软件对金属硫蛋白的空间结构进行分析表明，天然金属硫蛋白的两个结构域之间具有较大的独立表明，天然金属硫蛋白的两个结构域之间具

19、有较大的独立性，是可以拆分和构建的，因而构建性，是可以拆分和构建的，因而构建 结构域的结构域的“二倍体二倍体的设想是可行的。的设想是可行的。n用化学合成的方法分别合成结构域和连接肽段的基因，并用化学合成的方法分别合成结构域和连接肽段的基因，并设法将它们拼接起来。再插入载体并转入植物细胞中，使设法将它们拼接起来。再插入载体并转入植物细胞中，使金属硫蛋白的金属硫蛋白的 结构域多倍体基因在植物中表达。结构域多倍体基因在植物中表达。3.2.2 合成全新蛋白质n基于天然蛋白质结构改造的蛋白质工程基于天然蛋白质结构改造的蛋白质工程可以优化蛋白质的活性，而全新蛋白质可以优化蛋白质的活性，而全新蛋白质设计是合

20、成具有新奇的结构与功能的新设计是合成具有新奇的结构与功能的新蛋白质。蛋白质。从头设计一个蛋白质的基本步骤：构建一个多肽链骨架构建一个多肽链骨架模型模型从已知三维结构的数据库中挑选出从已知三维结构的数据库中挑选出一个合适的片段，进行修改和组合一个合适的片段，进行修改和组合依据氨基酸残基的统计学数据和排依据氨基酸残基的统计学数据和排列的优先顺序，确定每个残基位置列的优先顺序，确定每个残基位置上的氨基酸上的氨基酸优化目标蛋白的三维模型优化目标蛋白的三维模型检验和考核所给定的目标蛋白质结检验和考核所给定的目标蛋白质结构是否合理，对所设计的模型做进构是否合理，对所设计的模型做进一步修正一步修正几轮的设计

21、、检验和再设计，获得几轮的设计、检验和再设计，获得一个正确折叠和带有人们预期功能一个正确折叠和带有人们预期功能的目标蛋白质的目标蛋白质内容n一、蛋白质的功能与结构一、蛋白质的功能与结构n二、蛋白质工程的诞生二、蛋白质工程的诞生n三、蛋白质工程的基本步骤和改造方法三、蛋白质工程的基本步骤和改造方法n四、蛋白质工程在食品产业中的应用四、蛋白质工程在食品产业中的应用四、蛋白质工程在食品产业中的应用n在实际生产中，可以应用蛋白质工程对一在实际生产中，可以应用蛋白质工程对一些生产中重要酶或蛋白质性质加以改造，些生产中重要酶或蛋白质性质加以改造，提高现有酶或蛋白质的工业实用性，如提提高现有酶或蛋白质的工业实用性，如提高酶的热稳定性、改变酶的最适高酶的热稳定性、改变酶的最适pHpH值条