干燥综合征泪腺组织中细胞凋亡及相关基因表达的研究

1、    干燥综合征泪腺组织中细胞凋亡及 相关基因表达的研究        【摘要】目的探讨干燥综合征（Sj?grens syndrome，SS）患者泪腺组织上皮细胞凋亡及其相关基因表达与SS组织损伤的关系。方法采用原位末端标记及免疫组织化学的方法，对12例SS患者及7例对照泪腺组织上皮细胞中的凋亡细胞及Fas、FasL、bcl-2和Bax等相关基因蛋白的表达进行检测。结果12例SS患者泪腺组织中上皮细胞凋亡数为（8.83±3.27）个/高倍视野；对照为（0

2、.88±0.52）个/高倍视野（P=0.000）。SS患者泪腺导管及腺泡上皮细胞中，Fas、FasL及Bax阳性表达的细胞数均明显高于对照组（P=0.000），与凋亡细胞数呈正相关（R=0.83，0.88，0.8；P=0.000）；bcl-2阳性表达的细胞数明显低于对照组，与凋亡细胞数呈负相关（R=-0.69，P=0.001）。结论SS患者泪腺组织中上皮细胞凋亡可能是导致腺体破坏进而功能丧失的原因之一；Fas、FasL及Bax增加以及bcl-2的减少皆与促进细胞凋亡有关。【关键词】干燥综合征；泪腺；细胞凋亡；癌基因Apoptosis and related gene expressi

3、on in lacrimal gland of cases with Sjögrens syndromeWU Jun, FEI Peifen, GONG Yihong, et al.Department of Ophthalmology, Peking Union Medical College Hospital, Beijing 100730, China【Abstract】ObjectiveTo assess the roles of apoptosis and expression of the related genes in lacrimal glandular destr

4、uction of patients with Sj?grens syndrome(SS). MethodsSmall pieces of palpebral lobes of lacrimal glands were obtained from 12 patients (10 with primary Sj?grens syndrome, 2 with secondary Sj?grens syndrome) and 7 normal controls. They had been investigated by the in situ end labeling and immunohist

5、ochemical staining to detect the apoptotic cells and the expression of Fas, FasL, bcl-2 and Bax. ResultsThe number of epithelial apoptotic cells in lacrimal glands of patients with SS was significantly higher than that in normal glands, and SS epithelial cells showed increased expression of Fas, Fas

6、L and Bax. There was significant positive correlation between the number of the apoptotic cells and that of the cells expressing Fas, FasL and Bax, respectively, and there was significant negative correlation between the number of the apoptotic cells and that of the cells expressing bcl-2. Conclusio

7、nsThe apoptosis of the epithelial cells in the lacrimal gland may be one of the mechanisms leading to the glandular destruction found in SS. In SS lacrimal glands, the expression of Fas, FasL and Bax may promote apoptosis, and the expression of bcl-2 may inhibit apoptosis.【Key words】Sjögrens sy

8、ndrome；Lacrimal gland；Apoptosis；Oncogenes干燥综合征（Sj?grens syndrome，SS）是慢性系统性自身免疫性疾病，其特征性病理改变为泪腺及唾液腺等外分泌腺组织灶性淋巴细胞浸润增殖，腺体组织进行性破坏，致使腺体分泌功能下降甚至丧失1，2。近年来的研究表明，SS实际上是腺体上皮细胞的病变，因而称为自身免疫性上皮炎3。患病年龄为3545岁，男女比例为19。近年来的研究表明，腺体细胞凋亡及相关基因的异常表达亦是自身免疫性疾病发病的重要因素。目前国外对于SS外周血及唾液腺中细胞凋亡的研究已有诸多报导4-6，但有关泪腺方面的研究仅见动物实验7，而国内既无动

9、物实验亦无临床研究的报道。因此，笔者采用原位末端标记及免疫组织化学方法，对多聚甲醛固定及石蜡包埋的SS患者及其对照的泪腺组织标本进行上皮细胞凋亡及相关基因表达的研究，旨在探讨SS泪腺组织破坏的机制。材料与方法1.对象：选择经本院免疫内科、眼科及口腔科确诊的SS 患者12例，均为女性。年龄1659岁，平均（40.67±8.90）岁。其中继发性SS 2例，原发性SS 10例。对照组7例均为男性，其中1例为绝对期青光眼患者，1例为泪腺脱垂患者，余5例均为非正常死亡的健康者。2.诊断标准8：（1）原发性干燥综合征（SS-°）：干燥性角、结膜炎；口干燥症；抗核抗体、类风湿因子、抗SS

10、A抗体及抗SSB抗体血清免疫学检查异常。（2）继发性干燥综合征（SS-°）：合并有明确的慢性炎症性结缔组织病。3.主要试剂和仪器：(1)试剂：原位细胞凋亡检测脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记法（terminal deoxynucleotidyl transferase mediated deoxyuridine triphosphate nick end labeling，TUNEL）试剂盒 （德国Boehringer Mannhein公司）。兔抗人Fas、FasL、Bax多抗、鼠抗人bcl-2单抗以及过氧化物酶标记链酶卵白素（streptavidin-per

11、oxidase，SP）免疫组织化学试剂盒（北京中山生物技术有限公司）。3，3-二氨基联苯胺（3，3-diaminobenzidine，DAB）显色剂（美国Sigma公司）。碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶试剂盒（APAAP，邦定生物医学公司）。(2)仪器：采用美国Meridian公司生产的Ultima 212型激光扫描共聚焦显微镜。天津LG电子电器有限公司生产的MS-2586DTW/G型微波炉。4.标本的取材及其处理：于局麻下取对照组及SS患者症状较重的患眼泪腺组织，直径约为3或4 mm，置于4% 多聚甲醛溶液中固定，包埋、HE染色，按文献2标准进行病理诊断。5.凋亡细胞原位检测：两组标本均采用微波修复

12、。按TUNEL试剂盒说明进行染色。经TUNEL反应液作用后，用碘化丙啶（PI）复染（含0.1%RNA酶），于激光共聚焦显微镜下观察。再滴加抗荧光素抗体-碱性磷酸酶联结物，NBT/BCIP显色，伊红复染，光学显微镜下计数凋亡细胞。阳性对照在滴加反应液前，置1 g/L DNase溶液中室温孵育15 min；阴性对照组仅加dUTP-FITC（不加TdT酶溶液）。6.免疫组织化学染色：切片均经微波修复后，滴加3% 的过氧化氢和140稀释的马血清液，去除内源性过氧化物酶并阻断其非特异性吸附。再分别滴加Fas、FasL、Bax多抗及bcl-2单抗稀释液，然后Fas、FasL及Bax按SP试剂盒说明进行检测

13、，DAB显色，苏木素复染；bcl-2按APAAP试剂盒说明进行检测，NBT/BCIP显色，甲基绿复染。阳性对照采用乳腺癌石蜡切片，阴性对照采用PBS液替代第1抗体。7.计数和统计学处理：随机统计两组57个高倍视野（400倍）中的凋亡细胞总数，计算每高倍视野下的平均细胞数。随机统计1 000个腺泡和导管上皮细胞中免疫组织化学染色阳性细胞总数。用SPSS 6.0软件进行两组t检验及相关性分析，并采用Excel 97软件绘制散点。结果1.两组细胞凋亡的比较：12例SS患者泪腺腺泡和导管上皮中均可见散在阳性凋亡细胞，平均为（8.83±3.27）个/高倍视野；光镜下见凋亡细胞的胞核呈蓝紫色，在

14、有的胞核中染色物质集中于核膜下呈不规则的环形或半月形，有的呈均匀凝集，还可见碎裂的细胞核（1）；激光扫描共焦显微镜检查，示凋亡细胞的胞核呈现绿色荧光，亦可见环形核及核碎裂形态（2）。对照组泪腺组织中，阳性凋亡细胞平均（0.88±0.52）个/高倍视野；两组间比较差异有显著性（t=8.23，P=0.000）（表1）。表1干燥综合征患者与对照组泪腺上皮细胞凋亡及基因蛋白表达的比较(±s)组别泪腺上皮Fas基因蛋白FasL基因蛋白bcl-2基因蛋白Bax基因蛋白例数凋亡细胞数(个/高倍视野)例数阳性细胞数(个/1 000个上皮细胞)例数阳性细胞数(个/1 000个上皮细胞)例数阳

15、性细胞数(个/1 000个上皮细胞)例数阳性细胞数(个/1 000个上皮细胞)SS组128.83±3.2712375.75±101.1912425.67±109.731299.08±69.427291.14±82.88对照组70.88±0.52785.86±46.537110.29±27.307363.57±75.99782.83±24.101SS患者泪腺组织中，可见蓝紫色阳性染色的上皮细胞凋亡的细胞核，染色集中于核膜下呈环状或位于一侧的半月形，有的呈均匀凝集状，有的为核碎裂状TUNEL（伊红复

16、染）×4002共聚焦显微镜深层光切片示SS患者泪腺组织中可见呈现绿色荧光的凋亡细胞核TUNEL荧光×4002.Fas和FasL及bcl-2和Bax蛋白的表达：SS患者组泪腺组织的导管及腺泡上皮细胞中，免疫组织化学染色可见大量Fas和FasL蛋白的阳性表达，阳性反应物呈棕黄色颗粒，主要定位于细胞的胞浆和胞膜，阳性细胞数分别为 （375.75±101.19）和（425.67±109.73）个/1 000个细胞。对照组泪腺组织阳性细胞数分别为Fas（85.86±46.53）和FasL（110.29±27.30）个/1 000个细胞；两组间比

17、较差异有显著性（tFas=7.09，tFasL=9.47；均P值=0.000）（表1，35）。此外，患者泪腺组织的导管及腺泡上皮细胞中Fas和FasL蛋白的阳性表达的细胞数与细胞凋亡数间呈正相关（R=0.83，0.88；P=0.000）（9）。 3正常泪腺组织仅见少数上皮细胞的胞浆内呈棕黄色阳性着染Fas SP（苏木素复染)×2004SS患者泪腺组织中可见大量上皮细胞的胞浆及胞膜呈棕黄色阳性着染Fas SP（苏木素复染）×4005SS患者泪腺组织中可见大量上皮细胞的胞浆及胞膜呈棕黄色阳性着染FasL SP（苏木素复染）×4006SS患者泪腺组织中可见较多的上皮细胞

18、的胞浆呈棕黄色阳性着染Bax SP（苏木素复染）×4007正常泪腺组织中可见大量上皮细胞的胞浆呈蓝色阳性着染Bcl-2 APAAP（甲基绿复染）×2008SS患者泪腺组织中仅见少量上皮细胞的胞浆呈蓝色阳性着染Bcl-2 APAAP（甲基绿复染）×2009SS患者泪腺组织Fas、FasL蛋白阳性表达的细胞数与细胞凋亡数的关系对照组及SS患者泪腺组织中，bcl-2的阳性细胞数分别为（363.57±75.99）和（99.08±69.42）个/1 000个细胞，对照组高于SS患者组（t=-7.74，P=0.000）；而Bax的阳性细胞数分别为（82.8

19、3±24.10）及（291.14±82.88）个/1 000个细胞，对照组明显低于SS患者组（t=6.34，P=0.000）（表1)，bcl-2呈蓝色阳性着染，Bax呈棕黄色阳性着染，二者皆主要定位于细胞浆(68）。bcl-2蛋白阳性表达的细胞数与细胞凋亡数呈负相关（R=-0.69，P=0.001）（10），而Bax蛋白阳性表达的细胞数与细胞凋亡数间呈正相关（R=0.80，P=0.001）。10SS患者泪腺组织bcl-2蛋白阳性表达的细胞数与细胞凋亡数的关系讨论1.SS患者腺体组织损伤与细胞凋亡的关系：目前有关SS患者腺体组织损伤的机制尚不清楚。Ogawa等4报道体外培养S

20、S患者的淋巴细胞中，T淋巴细胞的凋亡明显增加，可能与体内T淋巴细胞处于激活状态有关。Kong等5认为，SS患者唾液腺腺泡、导管上皮细胞及浸润淋巴细胞的凋亡，可能是导致SS患者腺体损伤原因之一。迄今，国内外尚未见有关SS患者泪腺组织细胞凋亡的报道。笔者首次对SS患者的泪腺组织进行了研究，发现导管及腺体上皮细胞中均有散在的凋亡细胞，其数量明显高于对照组。因此认为细胞凋亡可能是SS患者泪腺组织破坏的重要原因之一。2.SS患者腺体组织损伤与Fas及FasL的关系：Fas是由Fas基因编码的跨膜蛋白，FasL是型膜蛋白。Fas与其配基FasL结合可诱导细胞凋亡9。Kong等5研究发现，SS患者唾液腺腺泡

21、、导管上皮细胞的Fas及FasL蛋白阳性表达均显著增加，认为Fas介导的细胞凋亡途径可能是导致SS患者唾液腺损坏的原因之一。本研究结果显示，SS患者泪腺组织腺泡上皮和导管上皮细胞中Fas和FasL蛋白的阳性表达的细胞数均明显高于对照组，与细胞凋亡数呈正相关。说明SS患者的泪腺组织上皮细胞的凋亡很可能是由Fas/FasL途径介导的。3.SS患者腺体组织损伤与bcl-2及Bax蛋白的关系：bcl-2是原癌基因，对细胞凋亡具有明显的抑制作用10。目前已相继发现了数个与bcl-2同源的基因，如bax、bcl-x、bad和mcl等基因，构成了bcl-2基因家族。Bax蛋白可促进细胞凋亡，对抗bcl-2蛋

22、白抑制细胞凋亡的作用11。Manganelli等6 发现在SS患者唇腺导管上皮细胞凋亡的同时，bcl-2蛋白的阳性表达的细胞数亦明显减少。本研究结果表明，SS患者泪腺组织腺上皮细胞bcl-2蛋白阳性表达的细胞数明显低于对照组，与泪腺组织细胞凋亡数呈负相关；而Bax蛋白阳性表达的细胞数则高于对照组，与泪腺组织细胞凋亡数呈正相关。因此认为bcl-2蛋白阳性表达的缺失可导致SS泪腺组织上皮细胞凋亡的增加，并破坏泪腺组织的上皮细胞，而Bax蛋白阳性表达的细胞数增加可促进细胞凋亡的发生。综上所述，SS患者泪腺组织上皮细胞的凋亡可能是导致腺体破坏进而功能丧失的原因之一，细胞凋亡受相关基因的调控。（本文18

23、见插页第14页）作者单位：吴军(100730 中国医学科学院 中国协和医科大学 北京协和医院眼科)费佩芬(100730 中国医学科学院 中国协和医科大学 北京协和医院眼科)赵家良(100730 中国医学科学院 中国协和医科大学 北京协和医院眼科)唐福林(100730 中国医学科学院 中国协和医科大学 北京协和医院免疫内科)龚伊红(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所病理室)董继红(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所病理室)参考文献1.Moutsopoulos HM, Chused TM, Mann DL, et al. Sj?grens syndrome (Sicca

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