奶牛瘤胃微生物BAC文库中ACCase基因的筛选与生物信息学分析

1、中国农业科学 2011,44(5):1015-1021Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2011.05.019奶牛瘤胃微生物BAC文库中ACCase基因的筛选与生物信息学分析赵圣国，王加启，卜登攀，刘开朗，朱雅新，周凌云(1中国农业科学院北京畜牧兽医研究所/动物营养学国家重点实验室，北京 100193；2中国科学院微生物研究所微生物资源前期开发国家重点实验室，北京 100080） 111121摘要：【目的】从奶牛瘤胃微生物BAC文库中筛选含乙酰CoA羧化酶（ACCase）基因的克隆子，并对其全长测序和生物信息学分

2、析。【方法】利用PCR序列驱动筛选法，从瘤胃微生物BAC文库中筛选ACCase基因，鸟枪法测定基因序列后，进行基因注释、比对和系统发育分析。【结果】筛选得到了含ACCase基因的克隆（U12），其插入片段序列（URE12）全长43 358 bp，GC含量为43.75%，经GeneMark程序预测含有38个基因，经Signature程序预测属于变形菌门。ACCase基因（Acc-32）编码159个氨基酸，与Elusimicrobium minutum的ACCase基因具有41%的相似度，编码蛋白分子量为17.89 kD，等电点为5.27，在距离Acc-32上游的33 kb区域，发现一段能编码AC

3、Case连接酶的基因。Acc-32的结合位点氨基酸残基为GQVICVIEAMKVFNELKA，系统发育分析表明Acc-32属于-变形菌纲。【结论】得到了含有ACCase基因的序列片段，并且ACCase基因具有新的结构特征。关键词：瘤胃微生物；BAC文库；乙酰CoA羧化酶；基因注释；生物信息学Screening and Bioinformatics Analysis of ACCase from aBAC Library of Dairy Cow Rumen MicrobiotaZHAO Sheng-guo1, WANG Jia-qi1, BU Deng-pan1, LIU Kai-lang 1

4、, ZHU Ya-xin2, ZHOU Ling-yun1(1Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences /Key Laboratory of Animal Nutrition, Beijing 100193;2Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100080)Abstract: 【Objective】 The objective of the experiment is to screen, sequenc

5、e and bioinformatical analyze the ACCase clone from a BAC library of the dairy cow rumen microbiota. 【Method】 ACCase gene was screened from BAC library of the rumen microbiota by PCR sequence-driven analysis. Whole insert sequence of screened clone was sequenced by shotgun method. Then it was analyz

6、ed by gene annotation, blast and phylogenetic tree analysis. 【Result】 One ACCase clone (U12) was obtained , and its insert fragment (URE12) had the length of 43 358 bp and GC content of 43.75%. URE12 contained 38 CDSs predicted by GeneMark software, and it was probably originated from Proteobacteria

7、 by Signature analysis. ACCase encoded by Acc-32 was predicted to be 159 amino acids with a molecular weight of 17.89 kD and pI of 5.27. Acc-32 had the similarity of 41% with that from Elusimicrobium minutum. The combining site AA residue of Acc-32 was GQVICVIEAMKVFNELKA, and Acc-32 belonged to -Pro

8、teobacteria by phylogenetic tree analysis. 【Conclusion】 The fragment containing ACCase was screened, and ACCase had some novel gene characteristics.Key words: rumen microbiota; BAC library; acetyl-CoA carboxylase; gene annotation; bioinformatics analysis0 引言【研究意义】乙酰辅酶A羧化酶（acetyl-CoAcarboxylase，ACCas

9、e）（EC ）能催化乙酰辅酶A经羧化反应形成丙二酸单酰辅酶A，该反应是脂肪酸合成途径的第一步，也是调控的关键步骤。产物丙收稿日期：2010-06-30；接受日期：2010-08-26基金项目：国家“973”计划项目（2011CB100804）联系方式：赵圣国，TelE-mail：zhaoshengguo1984。通信作者王加启，TelE-mail：wang-jia-qi1016 中 国 农 业 科 学 44卷二酸单酰辅酶A不仅是生物体中脂肪酸合成的二碳单位供体，而且在许多产抗生素的放线菌中它还参与聚酮体的合成1。由于脂肪酸是

10、所有细胞膜脂的组成成分，在多细胞生物中还是重要的能量储备物，而ACCase所催化的反应又是脂肪酸生物合成途径的第一步，因此对ACCase的研究广受关注。【前人研究进展】在高等哺乳动物2、植物3及微生物4中，ACCase是一类以生物素为辅基、以碳酸氢根作羧基供体的羧化酶，同时需要Mg2+和ATP。该酶催化的反应可分为2个独立的半反应。大肠杆菌的ACCase是由3个部分组成的酶复合体，包括生物素羧化酶（biotin carboxylase，BC）、生物素羧基载体蛋白（biotin carboxyl carrier protein，BCCP）和羧基转移酶（carboxyl transferase，C

11、T）5。奶牛瘤胃中寄居着大量能合成脂肪酸的微生物，是机体脂肪酸代谢的重要参与者6，而研究发现瘤胃中89%的微生物是难以分离培养的7。元基因组学是不依赖于纯培养而发展起来的新型研究方法，是指某一特定的环境中全部微生物的总DNA。元基因组技术是将样品中的总DNA提取出来后，利用适宜的载体克隆到宿主细胞中以构建成元基因组文库，再筛选新的活性物质或基因8。如今，利用元基因组技术筛选到了新的脂酶/酯酶、蛋白酶、淀粉酶、氧化酶、几丁质酶、核酸酶、色素、抗肿瘤活性物质及抗生素抗性基因等9。【本研究切入点】目前，对于瘤胃微生物脂肪酸合成中ACCase基因信息的认识缺乏，并且通过分离培养瘤胃微生物获得ACCas

12、e基因信息的方法局限性很大。【拟解决的关键问题】本研究利用元基因组学方法，通过序列驱动法从奶牛瘤胃微生物BAC文库中筛选ACCase基因，全长测序后进行生物信息学分析，以期了解ACCase基因新的特征。1 材料与方法1.1 奶牛瘤胃微生物BAC文库奶牛瘤胃微生物BAC（元基因组）文库由中国科学院微生物研究所和中国农业科学院北京畜牧兽医研究所联合构建10。利用0.8%低熔点琼脂糖包埋法，获得奶牛瘤胃微生物高分子量的总DNA，经Hind 酶切消化，回收50200 kb DNA，与pCC1BAC载体连接后电击转化E.coli EPI300，构建奶牛瘤胃微生物BAC文库。该文库的平均插入片段54.5

13、kb，共保存15 360个克隆，文库容量为837 Mb。以每个细菌基因组大小为4 Mb计算，该文库覆盖209种瘤胃细菌。1.2 利用PCR引物筛选ACCase随机挑取1 000个BAC克隆子，利用碱裂解法小量提取质粒，并纯化。根据已知的ACCase基因序列，设计并合成了用于筛选ACCase基因的引物，该基因的上游引物为5-ACGCTTCTCCGGTTAATGG-3，下游引物为5-GCACATCCCCGGTATCAAA-3。以提取的BAC克隆质粒为模板，加入适量引物、dNTP和Taq酶进行聚合酶链式反应。循环条件为：94变性3 min；94变性1 min、55退火1 min、72延伸1 min，

14、共30个循环，最后72延伸1 min。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定是否有ACCase基因，目标序列长度470 bp。 1.3 对含ACCase的BAC克隆子全长测序根据PCR反应结果，挑取一个含ACCase基因的克隆子，命名为URE12，送北京华大基因研究公司利用鸟枪法测序，并将测序结果提交到GenBank。 1.4 URE12的基因和功能分析利用GeneMark软件对URE12测序结果进行 基因预测（/GeneMark/heuristic_hmm2.cgi）11。利用Blastx和Blastp程序比对GenBank数据库，对预测的基因进行同

15、源性比对搜索。将预测的各个基因与COG数据库进行比对，以确定各个基因的功能。利用ExPASy（http:/www.expasy. ch/）预测URE12的分子量和等电点，利用SignalP 3.0预测URE12的信号肽序列。为了确定URE12的系统分类学地位，将URE12提交到Signature程序进行分析（http:/www.cmbi.ru.nl/signature/cgi-bin/display.pl?disp=home）12。将从swiss-prot数据库下载的ACCase氨基酸序列与Acc-32氨基酸序列导入Clustal W软件进行多重比对。以保守的氨基酸序列，利用Mega 4.0中

16、的邻接法（Neighbor-Joining）建立ACCase基因的系统发育树，其中的遗传距离用Tamura-Nei公式计算，分支长度代表了分歧程度，各支上的数字是1000次bootstrap重抽样分析的支持百分比。2 结果2.1 PCR筛选ACCase基因以1 000个BAC质粒为模板，根据设计的乙酰CoA引物扩增乙酰CoA基因，扩增得到1个含ACCase基因的克隆，ACCase基因片段长度约470 bp。 2.2 BAC克隆插入片段URE12的序列特征挑取具有ACCase基因的BAC克隆U12，利用鸟枪法测序，对测序结果进行基因注释，并提交到GenBank（FJ529690）（表1）。U12

17、的插入片段（URE12）5期 赵圣国等：奶牛瘤胃微生物BAC文库中ACCase基因的筛选与生物信息学分析 1017 表1 URE12的基因注释 Table 1 URE12 gene annotationCDS编码位置 Coding site方向氨基酸 AA residue1 <1-1014 + 337 ATP水解酶 AAA ATPase (COG5271) 2 1032-3125 + 697 UV损伤内切酶 UvrABC (COG0322) 3 3142-3756 + 204 乙酰CoA羧化酶连接酶acetyl-CoA-carboxylase ligase (COG0340)4 3759

18、-4622 + 287 铁硫簇 4Fe-4S cluster binding (COG1600) 6 5226-6524 - 432 保守蛋白 UCP016719Conserved protein UCP016719 (COG3876)7 6623-7915 - 430 膜结合溶解转糖基酶 MltA domain protein (COG2821) 9 9701-10240 - 179 乙酰转移酶 Acetyltransferase (COG0456) 10 10321-12678 + 785 假定蛋白 MELB17_24182Hypothetical protein MELB17_24182

19、11 12906-16607 + 1233 假定蛋白pc1742 Hypothetical protein pc1742 12 16637-18484 + 615 假定蛋白F116p60 Hypothetical protein F116p60 13 18757-19488 - 243 毒力蛋白 Virulence protein (COG3943)14 20564-20908 + 114 5-磷酸核糖异构酶A Ribose-5-phosphate isomerase A 15 21070-21321 + 83 60S核糖体蛋白 L7 60S ribosomal protein L7a 16

20、21311-22315 + 334 假定蛋白 Hypothetical protein 18 22647-22850 + 67 无None19 22847-23302 + 151 外膜受体蛋白TonB铁载体受体TonB-dependent siderophore receptor20 23507-23998 + 163 SsrA结合蛋白 SsrA-binding protein (COG0691) 21 24080-24445 - 121 假定蛋白 Hypothetical protein22 24614-24940 + 108 假定蛋白Emin_0235 Hypothetical prote

21、in Emin_0235 23 24959-25753 + 264 肽酶 Peptidase (COG1989)24 25833-26405 - 190 假定蛋白FNV0997 Hypothetical protein FNV0997 25 26488-29118 - 876 假定钙粘蛋白Hypothetical cadherin domain containing protein (NOG16995)26 29157-30524 - 455 TPR重复蛋白 TPR repeat-containing protein (NOG06853) 27 30696-31805 + 369 锌金属肽酶

22、Zinc metallopeptidase (COG0501) 28 31885-34656 + 923 保守蛋白CLOSS21_01457Conserved protein CLOSS21_01457 (COG2217)29 34956-35225 + 89 30S核糖体 S15 30S ribosomal protein S15 (COG0184) 30 35234-36325 + 363 聚核糖核苷酸转移酶Polyribonucleotide nucleotidyltransferase (COG1185)31 36297-36923 + 208 聚核糖核苷酸转移酶Polyribonuc

23、leotide nucleotidyltransferase (COG1185)32 (Acc-32)36992-37471 + 159乙酰CoA羧化酶Acetyl-CoA carboxylase (COG0340)Elusimicrobium minutum (0.016) Elusimicrobium minutum (0.0) Elusimicrobium minutum (2e-15) Elusimicrobium minutum (3e-26) Desulfovibrio vulgaris (6e-18) Clostridium botulinum (0.58)50 46 31 41

24、 42 34Elusimicrobium minutum (4e-27)41Elusimicrobium minutum ( 6e-66)57Leptospira biflexa (5e-23)63Elusimicrobium minutum (8e-65) 43 Xanthobacter autotrophicus (5e-12) Psychrobacter arcticus (1e-10) Clostridium sp. (0.0)23 26 50Elusimicrobium minutum (8e-40) Elusimicrobium minutum (3.6e-05 ) Elusimi

25、crobium minutum (4e-10) Elusimicrobium minutum (6e-55) Fusobacterium nucleatum (6.1e-06 )53 41 41 49 24Protochlamydia amoebophila (0.006) Pseudomonas phage (6e-12) Haemophilus influenzae (8e-42) Vesicomyosocius okutanii (0.067 ) Plasmodium yoelii (0.88 ) Thermobifida fusca (0.17 ) 无NonePseudoalterom

26、onas atlantica (0.14)26 28 37 37 40 29 38 无None31Desulfatibacillum alkenivorans (3e-69)Streptococcus gordonii (1e-38) Marinobacter sp. (5e-06)38 28 45 358 7997-9595 + 532 5'-核苷酸酶 5'-nucleotidase domain-containing protein (COG6737)Elusimicrobium minutum (1e-46)Thiomicrospira crunogena (1e-30)

27、 Planctomyces maris (1e-93)45 39 455 4742-5113 - 123 反应调节受体 Response regulator receiver protein (COG4566)Elusimicrobium minutum (1e-19)Maricaulis maris (1e-56) Elusimicrobium minutum (0.0) Elusimicrobium minutum (7e-22)预测功能（COG编号）Putative function (COG number and classification)同源物种Most similar homo

28、logue (e value)相似度Identity（%）39 59 31Strand 残基17 22312-22656 + 114 假定蛋白COLAER_00268 Hypothetical protein COLAER_00268Collinsella aerofaciens (0.21)Uncultured marine bacterium (1.1e-16)2833 37487-37729 + 80 假定蛋白Emin_0416 Hypothetical protein Emin_0416 34 37738-40251 + 837 细胞分裂蛋白 Cell divisionFtsK/Spo

29、III E (COG1674) 35 40248-41081 + 277 外膜脂蛋白载体LolAOuter membrane lipoprotein carrier protein LolA (COG2834)36 41150-41773 + 207 3-磷脂酰转移酶 3-phosphatidyltransferase (COG0558) 37 41770-42270 + 166 磷脂酰甘油磷酸酶Phosphatidylglycerophosphatase (COG1267)38 42306->43358 + 351 假定蛋白 Hypothetical protein1018 中 国 农

30、 业 科 学 44卷长度为43 358 bp，GC含量为43.75%。经GeneMark分析，插入片段共编码38个蛋白（氨基酸残基50），其中ACCase基因位于CDS32（Acc-32）。同时CDS3（第3 142到第3 756个碱基）能编码ACCase连接酶。URE12编码的蛋白中，有1个（2.63%）是未知蛋白，10个（26.32%）是推测蛋白，2个（5.26%）是保守蛋白，25个（65.79%）是已知功能的蛋白。将38个基因编码的氨基酸残基与COG数据库比对后，可以看出，在编码的已知蛋白中，38%参与细胞加工和信号转导功能，17%参与信息贮存加工，8%参与辅酶转运代谢和脂类转移代谢（图

31、1）。 2.3 URE12的系统发育树分析利用Signature在线分析软件，分析URE12序列中的同源基因，发现含有24个同源族（orthologous groups），其中2个是标签基因（signature gene），分别是TPR重复蛋白（NOG06853）和假定钙粘蛋白（NOG16995），相对应的进化树分支分别是-变形菌纲（除立克次体目）和变形菌门（图2）。由此说图1 URE12的COG功能分类Fig. 1 COG functional classification of URE12明，URE12是来自于变形菌门中的某个细菌。 2.4 ACCase基因（Acc-32）序列分析ACCa

32、se的编码基因编号为Acc-32，转录翻译起始于第36 992个碱基，终止于第34 471个碱基，编码具有159个氨基酸的蛋白，分子质量为17.89 kD，等电点为5.27。Blastn比对分析表明，Acc-32与Elusimicrobium minutum具有41%的相似度，e值为3e-97。利用SignalP预测Acc-32信号肽，结果表明该基因没有信号肽。将Acc-32编码的蛋白序列与已知Accase蛋白序列进行全局比对，结果见图3。预测出该Acc-32的底物结合位点的氨基酸残基为GQVICVIEAMKVFNELKA，属于生物素酶家族。通过与已知ACCase蛋白序列多重比对后，利用Meg

33、a软件，以邻近法建树分析（图4）。从图4可以看出，ACCase基因在进行进化树分析时，可以分成5个簇，分别是-变形菌纲、-变形菌纲、-变形菌纲、-变形菌纲及-变形菌纲和硬壁菌门，而Acc-32则是属于-变形菌纲。3 讨论瘤胃被认为是复杂碳水化合物降解效率最高的天然厌氧发酵罐，蕴含着丰富的微生物基因资源，研究者已经从中分离得到了纤维素酶、木聚糖酶、淀粉酶、产甲烷和蛋白酶等基因13-14。传统意义上，常直接以混合微生物基因组为模板，利用PCR的方法筛选目的基因，但该技术的缺点是对于低丰度微生物基因，PCR效率很低；所以，只能扩增出高丰度的微生物基因组，这对于全面认识瘤胃微生物基因资源是很有限的。而

34、元基因组文库技术是所有微生物基因组的综合，对单个克隆进行PCR，在一定程度上完全反映了瘤胃微生物真实信息。元基因组序列驱动筛选方法是筛选新基因的一种有效方法，Kim等15以催化位点（Ser、Asp、His）和氧离子洞（HG）保守区设计引物PCR筛选得到了6种新脂肪酶。本研究通过构建具有大容量的BAC文库（平均插入片段54.5 kb），对含ACCase基因的克隆进行鸟枪法测序，利用生物信息学的方法，对该克隆所含的基因进行注释、功能分析和系统发育5期 赵圣国等：奶牛瘤胃微生物BAC文库中ACCase基因的筛选与生物信息学分析1019黑色表示该物种同时有两个标签基因，灰色表示该物种只有1个标签基因B

35、lack represents that the species contain two signature gene, gray represents that the species contain one signature gene图2 标签基因（NOG06853和NOG16995）在进化树上的分布Fig. 2 Distribution of Signature genes (NOG06853 and NOG16995) in phylogenetic tree分析，在一定程度上丰富了对瘤胃微生物基因资源的认识。ACCase是一种多酶复合体，在植物、动物、微生物中都有编码基因。原核生物

36、E.coli中，ACCase基因常呈簇状排列16。ACCase属于生物素羧化酶家族，该家族能通过自身的生物素转移活性羧基基团的转移，发挥生物作用，未结合生物素的ACCase是不具有生物活性的。ACCase的生物素化（活化）过程，也就是生物素与ACCase的结合过程，该过程需要生物素连接酶催化完成17。在本研究中，正好在相距ACCase基因约33 kb附近发现了ACCase连接酶（EC 5）基因，说明ACCase的生物素化具有一定的空间交叉性，两个基因能顺时表达。活化过程中ACCase连接酶在ATP的协助下，首先将生物素活化为生物素-5-AMP，然后在ACCase连接酶催化下将生物

37、素-5-AMP上的生物素转移到ACCase的亚单位BCCP赖氨酸残基上，从而生物素化ACCase。生物素化后的ACCase能在脂肪酸合成、氨基酸降解和CO2固定中起到作用18。ACCase基因的上下游未发现编码BC和CT的基1020 中 国 农 业 科 学 44卷图3 Acc-32氨基酸序列多重比对Fig. 3 Multialigment of Acc-32 aa sequence图4 Acc-32的系统发育树分析Fig. 4 Phylogenetic tree analysis of Acc-32因，与大肠杆菌的ACCase基因结构不同19，说明这可能是一种新的ACCase基因排列方式。多重

38、比对和系统发育树分析，常用于对未知序列的共同特征和物种归属分析，本研究通过与已知的ACCase基因比对， 两 个基 因能 顺 时表 达。 活 化过 程中 ACCase 连接酶在 ATP 的协助下，首先将生物素活化 为生物素-5-AMP， 然后在 ACCase 连接酶催化下将生 物素-5-AMP 上的生物素转移到 ACCase 的亚单位 BCCP 赖氨酸残基上，从而生物素化 ACCase。生物素 化后的 ACCase 能在脂肪酸合成、氨基酸降解和 CO2 固定中起到作用18。 ACCase 基因的上下游未发现编码 BC 和 CT 的基 。ACCase 属于生物素羧化酶家 族，该家族能通过自身的生物素转移活性羧基基团的 转移，发挥生物作用，未结合生物素的 ACCase 是不 具有生物活性的。ACCase 的生物素化（活化）过程， 也就是生物素与 ACCase 的结合过程，该过程需要生 物素连接酶催化完成 17 。在本研究中，正好在相距 1020 中 国 农 业 科 学 44 卷 图3 Fig. 3 Acc-32 氨基酸序列多重比对 Multialigment of Acc-32 aa sequence