杜氏利什曼原虫amastin基因重组真核表达质粒的构建与表达

1、杜氏利什曼原虫 amastin 基因重组真核表达质粒的构建与表达作者：李金福 , 陈建平 , 杨志伟 , 田玉, 马莹, 胡孝素【关键词】 杜氏利什曼原虫 ;, 无鞭毛体蛋白基因 ;, 体外表达Construction and expression of recombinant eucaryotic expression plasmid of amastin gene of Leishmania DonovaniAbstract AIM: To construct recombinant eukaryotic expression plasmid of amastin gene of Leis

2、hmania Donovani anddetectexpressionofthegeneinNIH3T3cells.METHODS: Amastin gene was amplified from nuclear DNA of Leishmania Donovani isolates and cloned into an eukaryotic expression vector pcDNA31(+). The recombinant plasmid was named pcDNA31amastin. NIH3T3 cell was transfected by pcDNA31amastin.

3、Transient and stable expression of amastin gene were detected by immunofluoresence and RTPCR. RESULTS: It was found that there was high green fluorescence on the cell membraneand inside the cell. It showed that NIH3T3 cell was transfected by pcDNA31amastin successfully. CONCLUSION: A recombinant euk

4、aryotic expression plasmid of amastin gene of Leishmania欢迎下载支持，谢谢！ Donovani was successfully constructed, and can be expressed stably in the NIH3T3 cells.KeywordsLeishmania Donovani; amastin gene; express in vitro 摘 要 目的 : 构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白 (amastin) 编码基因的真核表达重组质粒 pcDNA31amastin, 并研究其在 NIH3T3 细胞中的表达。方

5、法：提取杜氏利什曼原虫基因组 DNA进行PCRT增。 将扩增的无鞭毛体蛋白基因片段导入质粒pcDNA31(+)中，构建真核表达重组质粒 pcDNA31amastin 以 pcDNA31amastin转染 NIH3T3细胞， 采用免疫荧光染色法和RTPC分别鉴定pcDNA31amastin的瞬时表达和 稳定表达。结果 ： 在细胞膜和细胞内均观察到较强的绿色荧光 , 表明 pcDNA31amastin成功地转入NIH3T3细胞，并在细胞膜和细胞内获得 短暂表达。稳定转染的NIH3T3细胞的总RNA经反转录后，用PCF扩增 出无鞭毛体蛋白基因 , 表明获得了稳定表达。结论 ： 成功地构建杜氏 利什曼

6、原虫无鞭毛体蛋白基因的真核表达重组质粒 , 并且该基因在 NIH3T3细胞中获得了稳定表达。 关键词 杜氏利什曼原虫 ; 无鞭毛体蛋白基因 ; 体外表达 杜氏利什曼原虫是一种胞内寄生原虫 , 由媒介昆虫白蛉传播其引起的黑热病致死率极高，WHO/TDR已将其列为6种重点防治的热 带病之一。因现有疫苗效果不够理想 , 目前尚无可大规模用于临床的 黑热病预防接种疫苗。 因而, 寻找有效的、 新的黑热病疫苗候选分子 已成为当今黑热病预防研究工作的重点。近年来 , 对无鞭毛体蛋白 (amastin) 的研究1, 2 使其有望成为一种黑热病疫苗的候选分子。 本 研究根据GenBank中登录的4种利什曼原虫

7、无鞭毛体蛋白编码基因的 序列 , 自行设计引物 , 克隆了杜氏利什曼原虫的无鞭毛体蛋白编码基 因，并将其导入质粒 pcDNA31(+)中，构建了真核表达重组质粒 pcDNA31amastin, 并在 NIH3T3 细胞中获得稳定表达 , 为进一步构建 黑热病无鞭毛体蛋白基因疫苗奠定了基础。1 材料和方法1.1 材 料 杜 氏 利 什 曼 原 虫 四 川 省 汶 川 县 人 分 离 株(MHOM/CN/90/SC10H及NIH3T3细胞均由本室保存。限制性内切酶 Bambi和Xho I为Fermentas公司产品。PCR扩增所用聚合酶 Premix Ex Taq 为宝生物工程(大连)有限公司产品

8、。胶回收试剂盒为 Bioer Tech no logy公司产品。质粒小量提取试剂盒为 Omega公司产品。T4 DNA 连接酶为 NewEngland Labs 公司产品。兔抗杜氏利什曼原虫血清由本 室自行制备 , FITC 标记的羊抗兔抗体为北京成文免疫化学研究室产 品。转染试剂KeygenTrans皿为南京凯基生物科技发展有限公司产品。 总RNA提取试剂盒及cDNA第 1链合成试剂盒均为上海生工生物技术有限公司产品。M199培养基、DMEM培养基及G418均为Gibco公司产品。1.2 方法虫体基因组DNA的提取 将虫株从液氮中取出，转入 NNN培养基中于27C培养7 d后，转入含150

9、mL/L小牛血清的M199 培养液中进行扩大培养。当虫体总数达5X 109- 1X 1010时收集虫体， 参照文献 3 的方法略加修改提取虫体基因组 DNA。1.2.2 PCR引物的设计和合成根据Gen Ba nk中登录的4种利 什曼原虫无鞭毛体蛋白编码基因的序列设计一对引物 , 在上游引物 P1的5端添加BamH I识别序列和保护序列，在下游引物P2的5 端添加 Xho I 识别序列和保护序列。 引物的合成由宝生物工程 （大连） 有 限 公 司 完 成 。 引 物 的 序 列 如 下 :P1:5 GGCGGATCCATGCTGTGCTCGTGCATCG线处为 BamH 酶切位点）； P2:

10、5 CGCCTCGAGCTACATTATAATCAGCAGCACCJ线处为 Xho I 酶切位点）。无鞭毛体蛋白基因的扩增 PCR反应条件为94C预变 性3 min,然后94C变性30 s, 60 C退火40 s, 72 C延伸40 s,共 30个循环，最后1个循环后于72C再延伸10 min。扩增产物经10 g/L 琼脂糖凝胶电泳鉴定。124无鞭毛体蛋白基因的克隆 将上述PCF产物、质粒载 体pcDNA31(+)分别以BamH I和Xho I双酶切，经胶回收试剂盒纯化 酶切后的产物 , 并用 T4 DNA 连接酶将无鞭毛体蛋白基因片段与质粒 pcDNA31(+)相连接。取连接产物转化预先制备

11、的大肠杆菌DH5x感受态细胞 , 将菌液均匀涂布于含氨苄青霉素的 LB 培养基平皿上 , 于 37C培养 16 h。重组质粒的PCF筛选与鉴定从上述LB平皿上，随机 挑取数个菌落分别接种入含有氨苄青霉素的 LB 液体培养基的试管中 , 于37C剧烈振摇培养过夜。以P1、P2为引物，从各管中分别取12 卩L菌液直接进行PCR扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，能 扩增出无鞭毛体蛋白基因片段者即为阳性的重组质粒。重组质粒的酶切鉴定 用质粒小量提取试剂盒从经PCF筛选、鉴定正确的阳性重组质粒克隆中提取重组质粒DNA,并进行 BamH I 和 Xho I 的双酶切及 BamH I 的单酶切 ,

12、酶切产物经 10 g/L 琼脂糖凝胶电泳鉴定。无鞭毛体蛋白基因序列的测定 使用双脱氧链终止法 全自动测序仪对PCF鉴定及酶切鉴定均正确的重组质粒进行测序。测 序工作由上海英骏生物技术有限公司完成。128 以pcDNA31amastin转染NIH3T3细胞 转染前24 h,将细胞培养瓶中生长状态良好的 NIH3T3细胞（使用含100 mL/L小牛血 清、1 X 105 U/L青霉素及100 mg/L链霉素的DME完全培养液培养） 用胰蛋白酶消化，按5X 105个/孔接种于6孔细胞培养板中，当细胞 生长至70%左右汇合时用于转染。实验分为pcDNA31（+）对照组和pcDNA31amastin实验

13、组。先将5卩g质粒DNAffl入到100卩L PBS中， 混匀后加入转染试剂10卩L,混匀，室温放置15 min。然后，在轻微 振摇培养板的同时将混合液逐滴加入孔中 , 以使混合液均匀分散。最 后将培养板放置于37C、50 mL/L C02培养箱中培养。目的基因瞬时表达的免疫荧光法检测 参照文献 8 的 方法略加修改。在 6 孔细胞培养板中制作细胞爬片 , 于转染后 48 h 依次经PBS清洗、40 g/L多聚甲醛固定30 min、PBS清洗、20 mL/L Triton X100处理15 min、PBS清洗及加封闭血清于 37C封闭15 min 后，加20卩L 1 : 200兔抗杜氏利什曼原

14、虫血清（4C过夜，PBS清洗） 及1 : 100 FITC标记的羊抗兔抗体（37C孵育15 min, PBS清洗），加 缓冲甘油封片后 , 在荧光显微镜下观察结果。 稳定表达目 的基因细胞克隆的 G418筛选转染48 h后，换用含300 mg/L G418 的培养液继续培养细胞 , 每 2 d 更换 1 次培养液。当空白对照孔中的 细胞完全死亡时 , 换用含 150 mg/L G418 的培养液继续培养 , 每 2 d 更换 1 次培养液 , 至稳定表达目的基因的细胞克隆出现时 , 接种入细胞培养瓶中扩大培养。目的基因稳定表达的RTPC鉴定 经G418筛选后存活 细胞生长至80注右汇合时，采用

15、总RNA提取试剂盒提取其总RNA所 获总RNA经反转录后，再用前述引物进行PCRT增，以鉴定其是否可 稳定表达无鞭毛体蛋白基因。2 结果2.1无鞭毛体蛋白基因的PCRT增用PC肪法从杜氏利什曼 原虫的基因组DNA中,扩增出同预期大小一致、 大小约550 bp的DNA 片段（图 1）。图1无鞭毛体蛋白基因PCRT增产物的琼脂糖凝胶电泳（略）Fig 1 Agarose gel electrophoresis of PCR product of amastin geneM:DNAmarker（DL2000）;1:Amastingenefragment;2:Negativecontrol.2.2重组质

16、粒的PCF鉴定 对随机挑取的LB平皿上的各菌落进行PCRT增筛选鉴定，绝大部分扩增出大小约550 bp的DNA片段； 而空质粒对照则为阴性（图 2）。图2重组质粒PCF产物的琼脂糖凝胶电泳分析（略）Fig 2 Agarose gel electrophoresis analysis of PCR product of recombinant plasmidM: DNAmarker（DL 2000）； 1: PCRproduct of pcDNA3.1（+）； 2: PCR product of pcDNA3.1amastin.2.3重组质粒的酶切鉴定 用BamH I和Xho I对PCF鉴定正

17、确的重组质粒进行双酶切 , 可见与空质粒等大大小约 5400 bp 的片段 和约550bp目的片段；用BamH对重组质粒进行单酶切，可见大小约 5900 bp 的片段（图 3）。图 3 重组质粒的酶切鉴定（略）Fig 3 Restriction enzyme digestion analysis of the recombinant plasmidM1:DNA marker(DL2000)； 1:pcDNA3.1(+)/BamH I； 2: pcDNA3.1amastin/BamH I; 3: pcDNA3.1amastin/BamH I+Xho I; M2: DNA marker(marke

18、r VI).2.4 目的基因表达的免疫荧光法检测 在荧光显微镜下 , pcDNA3.1amastin转染的NIH3T3细胞的细胞膜和细胞质内均有较强的 绿色荧光(图 4A), 同一视野中的细胞在普通光下形态清晰 (图 4B), 表明pcDNA3.1amastin已成功地转入NIH3T3细胞，并在细胞膜和细胞 质内短暂表达；而空质粒pcDNA31(+)转染的NIH3T3细胞在荧光显微 镜下未显示绿色荧光 (图 4C), 同一视野中的细胞在普通光下形态也 清晰(图 4D)。图4重组质粒pcDNA3.1amastin在NIH3T3细胞中表达的免 疫荧光法检测(略)Fig 4 Immunofluore

19、scence analysis of the expression ofrecomb inant plasmid pcDNA3.1amastin in NIH3T3 cells ( x 200)A: NIH3T3 cells transfected by pcDNA3.1amastin (under fluorescence microscope)； B: NIH3T3 cells transfected by pcDNA3.1amastin (under lightmicroscope)；C:NIH3T3cellstransfectedbypcDNA3.1(+)(underfluoresce

20、ncemicroscope)； D: NIH3T3 cells transfected by pcDNA3.1(+) (underlight microscope).2.5 pcDNA3.1amastin在NIH3T3细胞中稳定表达的 RTPC鉴 定 经G418筛选后，存活细胞的总RNA经RTPCF可扩增出无鞭毛体蛋 白基因；而空质粒pcDNA3.1(+)转染的NIH3T3细胞总RNA经RTPC未 扩增出任何产物(图5),表明无鞭毛体蛋白基因在 NIH3T3细胞中获 得稳定表达。图5 pcDNA3.1amastin在NIH3T3细胞中表达的 RTPCF检测 (略)Fig 5 Detection

21、 of the expression of pcDNA3.1amastin in NIH3T3 by RTPCRM: DNAmarker(DL 2000)； 1: RTPCRproduct in N I H 3T3 cells transfected by pcDNA3.1amastin； 2: RTPCRproduct in NIH3T3cells transfected by pcDNA3.1(+)； 3: Positive control.3 讨论杜氏利什曼原虫隐性感染者或黑热病患者康复后 , 体内可产 生针对该原虫的持久保护性免疫应答 , 以防止再感染 , 说明利用免疫 预防接种防止杜

22、氏利什曼原虫的感染是可行的。免疫预防的免疫原可 以来源于基因工程表达的蛋白或其亚单位 , 也可以是编码该蛋白的基 因, 但选择目的蛋白或其编码基因作为免疫原则至关重要。 1994 年, Teixeira等1通过对锥虫cDNA文库的差异筛选，在国际上首次报道 并成功克隆了位于锥虫虫体表面的无鞭毛体蛋白基因。 2000 年, 成军 等4 利用核苷酸数据库计算机联网检索 , 发现与锥虫无鞭毛体蛋白 基因同源的硕大利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因部分片段 , 之后在全球 首次成功地克隆了硕大利什曼原虫的无鞭毛体蛋白基因。迄今已经发 现无鞭毛体蛋白家族由 45 个成员所组成 , 所有成员都拥有一个高度 保守的

23、由 11 个氨基酸组成的胞外结构域 , 并且主要表达在锥虫和利 什曼原虫的无鞭毛体时期，是一种期特异性表达蛋白5。Salotra等 的研究表明，在患黑热病后皮肤利什曼病（PKDL时无鞭毛体蛋白 的表达上调 , 其在改变患者的临床表现上可能起重要作用 , 以致影响 黑热病的临床治疗效果。 Stober 等7 对 100 种新的硕大利什曼原虫 的候选疫苗进行了筛选 , 发现无鞭毛体蛋白是一种最有前途的保护性 抗原。加之由于无鞭毛体蛋白位于利什曼原虫虫体的表面 , 在利什曼 原虫感染宿主后便有更多与宿主免疫系统接触的机会 , 因而有望成为 抗利什曼原虫感染的候选疫苗。本研究中克隆了利什曼原虫中对人生

24、命威胁最大的杜氏利什曼原虫的无鞭毛体蛋白基因（GenBank中的登录号为DQ864502）,成功 地构建了其真核表达重组质粒 pcDNA31amastir。以其转染NIH3T3细 胞后, 用免疫荧光法检测显示 , 在 NIH3T3 细胞的细胞膜和细胞质内均有绿色荧光。经G418筛选后存活细胞的总RNA经RTPC扩增出无鞭 毛体蛋白基因 , 表明无鞭毛体蛋白基因可在真核细胞中稳定表达 , 为 黑热病无鞭毛体蛋白基因疫苗的研制提供了实验依据。参考文献 :1 Teixeira SM, Russell DG, Kirchhoff CY, et al.Differentially expressed g

25、ene family encoding“ amastin ” , asurface protein of Trypanosomacruzi amastigotesJ. J Biol Chem, 1994, 269(32): 20509-20516.2 成 军, 钟彦伟 , 刘 妍, 等. 利什曼原虫无鞭毛体蛋白 的基因克隆化与序列分析 J. 中华传染病杂志 , 2001, 19(1): 27-31.3 Smyth AJ, Ghosh A, Hassan MQ, et al. Rapid and sensitive detection of leishmania kinetoplast DNA from spleen and blood samples