蛋白序列测定

1、第三节蛋白质的一级结构蛋白质的相关概念肽的命名、书写及特点测序过程一、相关概念一、相关概念 1.1.蛋白质的一级结构（蛋白质的一级结构（Primary structurePrimary structure）: :又称为共价结构或化学结构。它是指蛋白质中的氨基酸（残基）的种类、排列顺序及连接方式。 特点：具有部分双键的性质,不可以旋转肽键比一般的碳-氧键短；与肽键相连的氢原子和氮原子呈反式反式； 2 2. .肽键肽键(peptide bond)(peptide bond) 一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基缩水形成的酰胺键（共价）键，称为肽键。3.肽肽(peptide)一个氨基酸的羧基羧基

2、与另一个氨基酸的氨基氨基缩水形成的化合物，称为肽肽。在蛋白质分子中，氨基酸借肽键连接起来，形成肽链肽链。肽和肽键的形成肽和肽键的形成肽单位肽单位肽键肽键肽平面肽平面4.4.残基残基(residue)(residue) 肽链分子中的每一个氨基酸，由于相互连接而失去一分子水，与原来的结构相比，分子稍有残缺，因此通常把肽链分子中的每一个氨基酸单位称为氨基酸残基(128/110).二、二、 肽的命名及书写肽的命名及书写1.命名：习惯：按数量的多少、按来源系统：某氨基酰某氨基酰某氨基酸2.书写：从N(H)到C (OH) ，具方向性三字母符号或单字母符号表示，中间用“”或“-”表示。例如例如:Gly-Gl

3、u-Lys-Ala (甘氨甘氨基基酰谷酰谷氨氨基基酰赖氨酰赖氨基基酰丙氨酸酰丙氨酸) 当两个氨基酸通过肽键相互连接形成二肽，当两个氨基酸通过肽键相互连接形成二肽，在在N N端仍然有游离的氨基和端仍然有游离的氨基和C C端有游离的羧基，每一端有游离的羧基，每一端连接更多的氨基酸。氨基酸能以肽键相互连接形端连接更多的氨基酸。氨基酸能以肽键相互连接形成长的、成长的、不带支链不带支链的寡肽和多肽。的寡肽和多肽。 多肽仍然有游离的多肽仍然有游离的-氨基和氨基和-羧基。羧基。 少于少于10AA称为称为寡肽寡肽，多于，多于10AA称为称为多肽多肽或聚肽。或聚肽。 分子量大于分子量大于10000d称为称为蛋白

4、质蛋白质，小于，小于10000d称称为多肽为多肽。 在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。质的亚单位。 但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状态但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常存在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为称为活性肽活性肽。 实例：谷胱甘肽实例：谷胱甘肽(glutathione,GSH) 短杆菌肽短杆菌肽;脑啡肽；脑啡肽； 促甲状腺素释放因子（促甲状腺素释放因子（TRH） -天冬氨酸天冬氨酸-苯丙氨酸甲酯（甜味剂）苯丙氨酸甲酯（甜味剂） 激素类多肽；抗生素类多肽；蛇毒

5、多肽激素类多肽；抗生素类多肽；蛇毒多肽等。等。重要的肽GSH的作用解毒作用：解毒作用：与毒物或药物结合，消除其毒性作用；参与氧化还原反应：参与氧化还原反应：作为重要的还原剂，参与体内多种氧化还原反应；保护巯基酶的活性：保护巯基酶的活性：使巯基酶的活性基团-SH维持还原状态； 维持红细胞膜结构的稳定：维持红细胞膜结构的稳定：消除氧化剂对红细胞膜结构的破坏作用。3.肽的理化特点：肽键的酰氨氢不解离，肽的酸碱性质主要决定于肽键中的游离末端-NH2、-COOH及侧链R基上的可解离基团；肽中末端-羧基的pKa值比游离氨基酸的大，末端 -氨基的pKa值比游离氨基酸的小(?)；游离的-氨基、 -羧基和R基可

6、发生与氨基酸中相应的类似反应，如茚三酮反应等；蛋白质部分水解后所得的肽若不发生消旋，则具有旋光性，短肽的旋光度约等于组成氨基酸的旋光度之和，较长的肽的旋光度则不是简单加和。二、蛋白质一级结构测定步骤二、蛋白质一级结构测定步骤测序前提：测序前提：l样品必须是均一的(纯度大于97%)l必须知道它的相对分子量，其误差允许在10%以内 1. .测定测定蛋白质分子中多肽链的数目蛋白质分子中多肽链的数目 2.2.拆分蛋白质分子的多肽链拆分蛋白质分子的多肽链 3.3.断开链内二硫键断开链内二硫键 4.4.分析每条多肽链的氨基酸组成比及数目分析每条多肽链的氨基酸组成比及数目 5.5.鉴定多肽链的鉴定多肽链的N

7、 N、C C瑞残基瑞残基 6.6.裂解多肽成小的肽段裂解多肽成小的肽段 7.7.测各肽段的氨基酸序列测各肽段的氨基酸序列 8.8.重建完整多肽链的一级结构重建完整多肽链的一级结构 9.9.确定二硫键的位置确定二硫键的位置测序过程测序过程(一一)N末端末端测定测定二硝基氟苯（二硝基氟苯（DNFB）法）法：肽游离末端NH2与DNFB反应生成DNP-肽黄色DNP-氨基酸丹磺酰氯（丹磺酰氯（DNS）法：）法：用DNS取代DNFB，生成DNS-氨基酸苯异硫氰酸（苯异硫氰酸（PITC）法：）法：生成PTH-氨基酸，从肽上断裂下来氨肽酶法：氨肽酶法：外切酶，但效果不好氨肽酶法氨肽酶法氨肽酶是一类外切酶，它从

8、肽链的N末端逐个向里切。 最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶亮氨酸氨肽酶 也会遇到N末端氨基封闭，用焦谷氨酸氨肽酶处理。 C-末端测定肼解法：最重要的化学方法，肽与肼反应，除C-末端氨基酸游离外，其他氨基酸转变为氨基酸酰肼化物还原法：C-末端氨基酸用硼氢化锂还原成相应的-氨基醇羧肽酶法：最有效、最常用羧肽酶A羧肽酶B羧肽酶Y羧肽酶C 氨基酸酰肼可以与苯甲醛苯甲醛作用变成水不溶性二苯基衍生物而沉淀 Gln Asn Cys等不易测出，末端Arg变成鸟氨酸羧肽酶法羧肽酶法本方法目前最有效。从羧基端开始向里逐一水解蛋白质 羧肽酶A：释放除Pro，Arg和Lys以个的所有C-末端残基羧肽酶B：只水解以碱性Ar

9、g和Lys为C-末端的肽键羧肽酶C：羧肽酶Y：可以作用于任何一个C-末端残基二硫二硫键的键的断裂断裂氧化法：过甲酸还原法：巯基化合物还原（-巯基乙醇，二硫苏糖醇等） 此外还需要加8mol/L 尿素或6mol/L的盐酸胍，使蛋白质变性。 生成的巯基要用碘乙酸等烷化剂保护。(三三)氨基酸氨基酸组成的测组成的测定：定：酸水解：是主要方法，同时辅以碱水解；所得氨基酸不消旋，但Trp全部被破坏，Ser，Thr，Tyr部分破坏，Asn和Gln的酰氨基被水解，生成Asp和Glu,同时释放出NH3；碱水解：多数氨基酸都被破坏，但Trp可定量回收(四四)多肽多肽链的链的部分部分裂解裂解酶裂解胰蛋白酶：专一性强，

10、断裂Lys或Arg的羧基羧基参与形成的肽键糜蛋白酶：断裂Phe，Trp，Tyr，Leu等疏水氨基酸的羧基羧基参与形成的肽键嗜热菌蛋白酶：专一性差，断裂Val，Leu，Phe，Tyr，Trp等氨基氨基参与形成的肽键胃蛋白酶：在酸性条件稳定酸性条件稳定，肽键两侧两侧均为疏水氨基酸。在确定二硫键位置时常用，专一性与糜蛋白质酶类似化学裂解溴化氰（CNBr）：只断裂Met羧基羧基形成的肽键羟氨（NH2OH）：在pH9时，专一断裂Asn-Gly之间的肽键，其它条件下不专一 今有一个七肽，经分析它的氨基酸组成是Lys，Pro, Arg, Phe, Ala,Tyr和Ser，该肽未经糜蛋白酶处理时，与DNFB反

11、应不产生-DNP-氨基酸，经糜蛋白酶作用后，此肽断裂成两肽段。其氨基酸组成分别是Ala, Ser, Tyr和Lys，Pro, Arg, Phe。这两个肽段分别与DNFB反应可分别生成DNP-Ser和DNP-Lys。此肽与胰蛋白酶反应，同样能生成两个肽段，它们的氨基酸组成分别是Arg, Pro和Phe, Tyr, Lys, Ser, Ala。试问此七肽的一级结构序列是怎样？(五五)肽肽段段的的氨氨基基酸酸测测序序Edman化学降解法：用Edman试剂PITC与游离氨基作用生成PTH- 氨基酸，并可用各种层析技术分离；现改用蛋白质测序仪。酶解法：利用氨肽酶和羧肽酶，局限性大，有困难质谱法：质谱仪由

12、核苷酸序列推定法：mRNA，cDNA，推出 cDNA的核苷酸序列，然后推测出蛋白质的氨基酸序列(六六)肽段在多肽段在多肽链中次肽链中次序的决定序的决定(七七)二硫键位置的确定：二硫键位置的确定： 对角线电流法： 一般采用胃蛋白酶水解原来的含二硫键的蛋白质。一是胃蛋白酶专一低，切点多，得到含有二硫键的肽段较小，易分离鉴定；二是在酸性条件下，有利于防止二硫键发生交换反应。 对角线电泳过程对角线电泳过程 ：把水解后的混合肽段点到：把水解后的混合肽段点到滤纸的中央，在滤纸的中央，在pH6.5条件下进行第一向电泳，肽条件下进行第一向电泳，肽段将按大小及电荷不同分离开，然后段将按大小及电荷不同分离开，然后

13、 把滤纸暴露把滤纸暴露在过甲酸蒸气中，使在过甲酸蒸气中，使S-S氧化成一对含磺酸基丙氨氧化成一对含磺酸基丙氨酸的肽。滤纸旋转酸的肽。滤纸旋转90度，在与第一向完全相同的条度，在与第一向完全相同的条件下进行第二向电泳。这时大多数氨基酸的迁移率件下进行第二向电泳。这时大多数氨基酸的迁移率未变，将位于滤纸的一条对角线上，而含磺基丙氨未变，将位于滤纸的一条对角线上，而含磺基丙氨酸的成对肽段将比原来含二硫键的肽小而负电荷增酸的成对肽段将比原来含二硫键的肽小而负电荷增加，结果它们都偏离了对角线。加，结果它们都偏离了对角线。 问题： 有一个A肽，经酸水解分析得知由Lys、Asp、Glu、Arg、Ala、Val 和Tyr组成 。当A肽与DNFB反应后，得DNP-Glu，当用羧肽酶羧肽酶处理后得游离Asp。如果我们在实验中将A肽用胰胰蛋白酶蛋白酶降解时，得到三个肽，其中一种(Arg、Gln、Tyr),在pH6.4时净电荷为+1，另一种(Ala、Lys) 第三种为（Val和Asn）在pH6.4