基因工程常规技术-相互作用研究技术

1、相互作用研究技术相互作用研究技术v在细胞的生命活动过程中，诸如在细胞的生命活动过程中，诸如DNA的复制与重组、的复制与重组、mRNA的转录与修饰，以及病毒的感染与增殖等，都涉的转录与修饰，以及病毒的感染与增殖等，都涉及到了特定的及到了特定的DNA区段与蛋白质结合因子或者蛋白质因区段与蛋白质结合因子或者蛋白质因子之间的相互作用。为了分析研究参与基因表达调控的子之间的相互作用。为了分析研究参与基因表达调控的DNA元件，分离鉴定同这些调控元件结合的特异的蛋白元件，分离鉴定同这些调控元件结合的特异的蛋白质因子，近年来已相继发展出了一系列专门用于研究相质因子，近年来已相继发展出了一系列专门用于研究相互作

2、用的实验技术。互作用的实验技术。vDNA与蛋白质相互作用分析技术与蛋白质相互作用分析技术v蛋白质与蛋白质相互作用分析技术蛋白质与蛋白质相互作用分析技术染色质免疫沉淀技术（染色质免疫沉淀技术（ChIP）v染色质免疫沉淀技术（染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay, CHIP）是用于研究是用于研究体内体内DNA与蛋白质相互作用与蛋白质相互作用的方法。它的基本原的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质理是在活细胞状态下固定蛋白质DNA复合物，复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通

3、过免疫学方法沉淀此复合体，特异性段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集与目的蛋白结合的地富集与目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互相互作用的信息。作用的信息。甲醛处理使蛋白质与甲醛处理使蛋白质与DNA交联交联染色质打断染色质打断沉淀沉淀蛋白质蛋白质-DNA交联交联复合体复合体解除交联，纯化解除交联，纯化DNA分析分析ChIP技术的发展技术的发展vChIP-on-chipvChIP-on-chip（定位分析）是一种基于芯片的强（定位分析）是一种基于芯片的强大方法，用于分析表观遗传修饰和结合到特

4、异性大方法，用于分析表观遗传修饰和结合到特异性调节蛋白的调节蛋白的 DNA 序列。序列。 简要地讲，在简要地讲，在 ChIP-on-chip 中，要对蛋白质中，要对蛋白质-DNA 复合物进行交联、免复合物进行交联、免疫沉淀、纯化、扩增和标记，随后使之与多种高疫沉淀、纯化、扩增和标记，随后使之与多种高分辨率芯片进行杂交。分辨率芯片进行杂交。vChIP-Seq基于基于ChIP的测序技术的测序技术v首先通过染色质免疫共沉淀技术（首先通过染色质免疫共沉淀技术（ChIP）特异性）特异性地富集目的地富集目的 蛋白结合的蛋白结合的DNA片段，并对其进行片段，并对其进行纯化与文库构建；然后对富集得到的纯化与文

5、库构建；然后对富集得到的DNA片段进片段进行高通量测序。研究人员通过将获得的数百万条行高通量测序。研究人员通过将获得的数百万条序列标签精确定位到基因组序列标签精确定位到基因组 上，从而获得全基因上，从而获得全基因组范围内与组蛋白、转录因子等互作的组范围内与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段区段信息。信息。 凝胶阻滞试验凝胶阻滞试验(EMSA)v凝胶阻滞试验凝胶阻滞试验 (gel retardation assay)，又叫做，又叫做DNA迁移率变动试验迁移率变动试验 (DNA electrophoretic mobility shift assay, EMSA)，是，是80年代初期出现年代初期出

6、现的用于的用于体外分析体外分析DNA与蛋白质相互作用与蛋白质相互作用的一种的一种特殊的凝胶电泳技术，它具有简单、快捷等优特殊的凝胶电泳技术，它具有简单、快捷等优点，也是当前被选作分离纯化特定点，也是当前被选作分离纯化特定DNA结合蛋结合蛋白质的一种经典实验方法。白质的一种经典实验方法。v原理：蛋白质与原理：蛋白质与DNA结合后将大大增加分子量，结合后将大大增加分子量，而凝胶电泳中而凝胶电泳中DNA朝正极移动的距离与其相对朝正极移动的距离与其相对分子质量的对数成正比，因此，没有结合蛋白分子质量的对数成正比，因此，没有结合蛋白质的质的DNA片段跑得很快，而与蛋白质形成复合片段跑得很快，而与蛋白质形

7、成复合物的物的DNA由于受到阻滞而跑得慢。当特定由于受到阻滞而跑得慢。当特定DNA片段与细胞提取物混合后，若复合物在凝胶电片段与细胞提取物混合后，若复合物在凝胶电泳中的迁移率小，就说明该泳中的迁移率小，就说明该DNA可能与提取物可能与提取物中某个蛋白质分子发生中某个蛋白质分子发生 了相互作用。了相互作用。方法：方法：同位素标记待测的同位素标记待测的DNA片段片段细胞提取物细胞提取物DNA-蛋白质复合物蛋白质复合物探针探针DNA温育温育PAGE电泳电泳放射自显影放射自显影进行进行DNA凝胶分析凝胶分析 vE M S A 可 以 通 过 加 入 超 量 的 非 标 记 的 竞 争可 以 通 过 加

8、 入 超 量 的 非 标 记 的 竞 争 D N A (competitor DNA)鉴定在特殊类型细胞的提取物中，是否鉴定在特殊类型细胞的提取物中，是否存在着能够同某一特定存在着能够同某一特定DNA片段结合的蛋白质分子片段结合的蛋白质分子 (比如比如特异的转录因子等特异的转录因子等)，以及发生此种结合作用的，以及发生此种结合作用的DNA序列序列的特异性。的特异性。v如果竞争如果竞争DNA与同位素标记的探针与同位素标记的探针DNA结合的是同一种结合的是同一种蛋白质，那么由于竞争蛋白质，那么由于竞争DNA与探针与探针DNA相比是极大超量相比是极大超量的，这样绝大部分蛋白质都会被其竞争结合掉而使探

9、针的，这样绝大部分蛋白质都会被其竞争结合掉而使探针DNA仍处于自由的状态，不会出现阻滞的条带。仍处于自由的状态，不会出现阻滞的条带。在凝胶阻滞实验中竞争在凝胶阻滞实验中竞争DNA与探针与探针DNA之间的之间的竞争作用竞争作用(a)没有加入竞争没有加入竞争DNA的的正常的凝胶阻滞实验，正常的凝胶阻滞实验，探针探针DNA与特异蛋白质与特异蛋白质结合，出现阻滞条带；结合，出现阻滞条带；(b)加入的超量竞争加入的超量竞争DNA与探针与探针DNA竞争结合同竞争结合同一种蛋白质，阻滞条带一种蛋白质，阻滞条带消失；消失；(c)竞争竞争DNA与探针与探针DNA分别结合不同的蛋白质分别结合不同的蛋白质，出现同，

10、出现同(a)一样的阻滞一样的阻滞条带。条带。 DNaseI足迹试验足迹试验v凝胶阻滞试验能够揭示出在体内发生的凝胶阻滞试验能够揭示出在体内发生的DNA与蛋白与蛋白质之间相互作用的有关信息，然而它却无法确定两质之间相互作用的有关信息，然而它却无法确定两者结合的准确部位。要解答这个问题，则需要应用者结合的准确部位。要解答这个问题，则需要应用DNaseI足迹试验足迹试验 (footprinting assay)。它是一类用。它是一类用于检测与特定蛋白质结合的于检测与特定蛋白质结合的DNA序列的部位及特性序列的部位及特性的专门的实验技术。的专门的实验技术。v在在DNaseI足迹试验过程中，首先是将待检

11、测的双足迹试验过程中，首先是将待检测的双链链DNA分子用分子用32P作作末端标记末端标记，并用限制酶去掉，并用限制酶去掉其中的一个末端，得到只一条链单末端标记双链其中的一个末端，得到只一条链单末端标记双链DNA分子，而后在体外同细胞蛋白质提取物混合。分子，而后在体外同细胞蛋白质提取物混合。待二者结合之后，再加入少量的待二者结合之后，再加入少量的DNaseI (它可沿它可沿着靶着靶DNA作随机单链切割作随机单链切割)消化消化DNA分子并控制分子并控制酶的用量使之达到平均每条酶的用量使之达到平均每条DNA链只发生一次磷链只发生一次磷酸二酯键断裂。酸二酯键断裂。v主要步骤：主要步骤： 用用32P标记

12、标记DNA双链末端，并用双链末端，并用RE切去一端；切去一端； 加入细胞特定周期蛋白质提取物，温育；加入细胞特定周期蛋白质提取物，温育； 加入适量加入适量DNaseI或硫酸二甲酯或硫酸二甲酯-六氢吡啶，使六氢吡啶，使DNA链发生断裂。链发生断裂。v这一反应中，这一反应中，DNaseI或硫酸二甲酯的用量非常关键，或硫酸二甲酯的用量非常关键，要保证一条链只发生一次断裂！要保证一条链只发生一次断裂！沉淀沉淀DNA（包括与（包括与DNA相结合的蛋白质）；相结合的蛋白质）；进行进行DNA凝胶分析。凝胶分析。 v如果某个蛋白质已经与如果某个蛋白质已经与DNA的特定区段相结合，那的特定区段相结合，那么，它就

13、会保证该区段么，它就会保证该区段DNA免受消化或降解作用。免受消化或降解作用。在电泳凝胶的放射自显影图片上，相应于蛋白质结在电泳凝胶的放射自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位不产生放射性标记的条带。合的部位不产生放射性标记的条带。 酵母单杂交酵母单杂交v酵母单杂交（酵母单杂交（yeast one-hybrid system)是一项常是一项常用于研究用于研究DNA与蛋白之间的相互作用的方法。与蛋白之间的相互作用的方法。v特点：通过该方法可以识别稳定结合于特点：通过该方法可以识别稳定结合于DNA上的上的蛋白质蛋白质 ，可在酵母细胞内研究真核生物，可在酵母细胞内研究真核生物DNA与与蛋白之间的相互作

14、用，并通过筛选蛋白之间的相互作用，并通过筛选DNA文库直接文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。转录激活结构域转录激活结构域（activation domain，AD）DNA结合结构域结合结构域（DNA binding domain，BD）基本原理：基本原理：顺式作用元件顺式作用元件报告基因得到表达报告基因得到表达激活激活Pmin启动子启动子真核生物转录因子基本构件真核生物转录因子基本构件操作流程操作流程cDNA与已知酵母转录激活与已知酵母转录激活结构域（结构域（AD）融合）融合导入酵母细胞导入酵母细胞基因产物基因产物（蛋白质）（蛋白质）顺式作用元件顺式作

15、用元件激活激活Pmin启动子启动子报告基因得到表达报告基因得到表达筛选阳性克隆筛选阳性克隆测序分析测序分析cDNA替换了编码结合结构域替换了编码结合结构域(BD)蛋白基因蛋白基因应用领域：应用领域：主要用于确定某个主要用于确定某个DNA分子与某个蛋白质之间是否分子与某个蛋白质之间是否存在相互作用；存在相互作用；用于分离编码结合于特定顺式调控元件或其他用于分离编码结合于特定顺式调控元件或其他DNA位点的功能编码基因；位点的功能编码基因；验证反式转录调控因子的验证反式转录调控因子的DNA结合结构域；结合结构域；准确定位参与特定蛋白质结合的核苷酸序列。准确定位参与特定蛋白质结合的核苷酸序列。Yeas

16、t Two Hybrid System (Interaction trap)90年代，纽约大学的年代，纽约大学的S. Field等建立。等建立。酵母双杂交系统酵母双杂交系统作用：有效地分离能与一种已知的靶蛋白相作用：有效地分离能与一种已知的靶蛋白相互作用的蛋白质互作用的蛋白质原理原理许多真核生物的许多真核生物的转录激活因子转录激活因子都是由两个在结都是由两个在结构上可以分开的、功能上也相互独立的构上可以分开的、功能上也相互独立的结构域结构域组成。组成。1. 结构域（结构域（Domain）合作）合作例如：例如： 啤酒酵母的半乳糖苷酶基因激活因子啤酒酵母的半乳糖苷酶基因激活因子GAL4:DNA b

17、inding domainActive domainNC1-147aa768-881aa上游激活序列（上游激活序列（UAS） 转录机转录机GAL4效应基因效应基因结合结合结合结合激活转录激活转录只要只要DNA binding domain（DNA-BD）与）与Active domain（AD）靠近就能够表现转录激活活性。）靠近就能够表现转录激活活性。实验发现：实验发现：转录表达转录表达2. 拆开拆开 DomainDNA binding domainActive domain上游激活序列（上游激活序列（UAS） 转录机转录机GAL4效应基因效应基因结合结合用重组用重组DNA技术把技术把GAL4的

18、两个的两个Domain分开，分开，就就丧失丧失了激活效应基因的能力。了激活效应基因的能力。不能转录不能转录3. 重组重组Domain用重组用重组DNA技术把这两个技术把这两个Domain分别与两个分别与两个不同的多肽连接。不同的多肽连接。Active domain蛋白蛋白A蛋白蛋白BDNA binding domain在体内，蛋白在体内，蛋白A与蛋白与蛋白B是否能结合。是否能结合。通过效应基因是否被激活来检查：通过效应基因是否被激活来检查：4. 观察报告基因表达观察报告基因表达上游激活序列（上游激活序列（UAS） 转录机转录机GAL4效应基因效应基因蛋白蛋白ADNA binding domai

19、n转录激活转录激活domain蛋白蛋白BGAL4的的DB domain与与AD Domain也不能靠也不能靠近，所以仍然不能启动效应基因的转录。近，所以仍然不能启动效应基因的转录。不能转录不能转录如果蛋白如果蛋白A与蛋白与蛋白B不能相互结合不能相互结合上游激活序列（上游激活序列（UAS） 转录机转录机GAL4效应基因效应基因蛋白蛋白ADNA binding domain转录激活转录激活domain蛋白蛋白B激活转录激活转录GAL4的的DB domain与与AD Domain也能靠近，也能靠近，所以能启动效应基因的转录。所以能启动效应基因的转录。转录表达转录表达如果蛋白如果蛋白A与蛋白与蛋白B能相互结合能相互结合双杂交原理双杂交原理X基因和基因和Y基因产基因产物的相互结合，物的相互结合，导致导致reporter gene表达。表达。Reporter gene表达表达就可说明就可说明X基因产基因产物与物与Y基因产物能基因产物能结合。结合。GST