丹参酮ⅡA对谷氨酸联合淀粉样蛋白诱导细胞损伤的保护作用

1、丹参酮A对谷氨酸联合淀粉样蛋白诱导细胞损伤的保护作用         10-09-10 15:37:00     编辑：studa20                  作者：张萌涛 钱亦华 杨杰 史利利 朱淑娟 刘朝晖 【摘要】  目的 探讨丹参酮A(TanA)对谷氨酸(Glu)联合淀粉

2、样蛋白2535 (A2535)诱导PC12细胞、Meynert核(nbM)神经元损伤的保护作用。方法 培养PC12细胞，用MTT法观察TanA三个不同浓度(2.5、5.0、10 mol/L)对Glu联合A2535损伤PC12细胞的保护作用;运用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)技术，检测急性分离nbM神经元在Glu联合A诱导损伤时细胞内钙离子浓度(Ca2+i)变化，及不同浓度TanA对这种Ca2+i变化的影响。结果 MTT检测结果表明，TanA 各组细胞活力、损伤程度与单纯A+Glu损伤组相比有显著差异(P<0.05)，但无剂量依赖关系。Glu联合A2535损伤组Ca2+i比对照组显著升高

3、(P<0.01);TanA 各组Ca2+i均较单独Glu联合A2535处理组有显著降低(P<0.01)。结论 TanA通过提高细胞活力、维持细胞内钙离子浓度稳态以对抗Glu联合A2535损伤作用。 【关键词】  阿尔茨海默病;淀粉样蛋白;谷氨酸;Meynert基底核;PC12细胞【Abstract】 Objective To explore the protection of TanshinoneA (TanA) on damage of PC12 cells and nucleus basalis of meynert (nbM) neurons induced by

4、glutamate (Glu) and amyloid protein 2535 (A2535). Methods MTT assay was used to observe the protection of different dosages of Tan A(2.5, 5.0, 10 mol/L)on cellular damage induced by Glu and A2535. Laser scanning confocal microscopy (LSCM) technique was adopted to detect the change of the intracellul

5、ar free calcium concentration (Ca2+i). Results There were significant differences on the cell survival and the extent of damage between the each Tan A group and A+Glu group (P<0.05), but there wasnt dosedependent manner. The level of Ca2+i in Glu+A2535 group was significantly higher than that of

6、control group (P<0.01). The level of Ca2+i in each Tan A goup was significantly lower than that of Glu+A2535 group(P<0.01). Conclusions Tan A can be against the cellular damage induced by Glu and A2535 through increasing cell survival and sustaining the homeostasis of Ca2+i.【Key words】 Alzheim

7、ers disease (AD); amyloid protein (A); Glutamate (Glu); Nucleus basalis of Meynert (nbM); PC12 cells 目前西医治疗阿尔茨海默病(AD)主要是停留在缓解症状上。相比之下，祖国医学在延缓衰老以及老年性疾病的防治方面有着丰富的理论和实践经验，具有潜在的优势和广阔的开发前景。中药丹参1属于活血化瘀类中药，同时具有养血安神功效。丹参酮A(TanA)为丹参有效成分之一，为脂溶性、樱红色、针状结晶。TanA分子式C19H18O3，分子量294.33，含有醌型结构，易被氧化还原，可参与机体的多种生化反应而有多种

8、生物活性，如降低血液黏滞度、扩张冠状动脉、抗血小板聚集、清除氧自由基、抗脂质氧化、抗肿瘤、抗菌、消炎、雌激素样作用、保护神经元细胞及改善心脑缺血等广泛的药理作用。在心肌缺血/灌注损伤防治中，TanA具有类异搏停样L型钙通道阻断剂作用2。本研究将探索TanA对谷氨酸(Glu)联合淀粉样蛋白2535(A2535)诱导PC12细胞、Meynert核(nbM)神经元损伤的保护作用，以便为寻找有效防治AD中药提供实验数据。1 材料与方法1.1 材料 TanA (西安鸿生生物技术有限公司);噻唑蓝(MTT)(Sigma公司);DMEM培养基(Gibco公司);新生牛血清(杭州四季青生物工程公司);Glu、

9、A2535、Fluo3/AM、HEPES、钙离子载体Ionomycin均购于美国Sigma公司;EGTA(Amresco)。PC12细胞为张葳蕤惠赠。实验动物：正常SD大鼠(1015 d)，体重约2030 g，雌雄不拘，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。1.2 方法1.2.1 PC12细胞的培养及大鼠nbM神经元的急性分离 PC12细胞用含有15%新生牛血清的DMEM培养基培养，置37、5% CO2培养箱内，隔2 d换液一次，当细胞生长达70%80%融合时传代、继续培养。取对数生长期的细胞用于实验。急性分离nbM神经元的方法参照文献3，4：根据包新民等5所编的大鼠脑立体定位图谱来定位nbM

10、。大鼠在10%水合氯醛腹腔麻醉下，快速断头取脑，移入冰的标准细胞外液(通O2)中冰浴约1 min，快速修剪后黏到标本台上放入切片机槽内切活脑片，片厚400 m，将切片移入标准细胞外液中(通O2)，孵育平衡50 min;31条件下，用 0.016% pronase E消化2030 min;再移入标准细胞外液中平衡1.52 h，用特制的针扎取nbM，放入充氧的标准细胞外液中，使用不同内径并经过热抛光的Pasteur玻璃管吹散组织块，使之成为单细胞悬液。移细胞悬液至多聚赖氨酸预处理的Petri培养皿中，20 min后待神经元完全贴附于培养皿上，用标准细胞外液轻轻冲洗培养皿23次，洗掉未贴壁的细胞及组

11、织碎片，继续下一步实验。整个实验过程在2026条件下进行。1.2.2 主要溶液及其配制 A的“老化处理”：将A2535溶解于消毒的三蒸水，37孵育72 h，使其变成聚集状的A，储备浓度10 mol/L，4保存，用时用DMEM培养液稀释成工作浓度;TanA配制：用二甲基亚砜(DMSO)避光震荡溶解TanA干粉，配成1 mmol/L储备浓度，4保存;用时再和培养液稀释成工作浓度;标准细胞外液(mmol/L)：NaCl 150，KCl 5，CaCl2 2，MgCl2 1，HEPES 10,葡萄糖10，将以上成分按浓度溶解于去离子水中，用Trisbase将pH值调至7.4;Fluo3/AM，用DMSO

12、配成885 mol/L，置20避光保存。1.3 实验处理1.3.1 PC12细胞的实验处理 取对数生长期的PC12细胞，使其密度约105个/ml，每孔100 l，接种于96孔板。实验分3组：空白对照组、Glu组、A+Glu损伤组，A+Glu损伤组又分为单纯A+Glu损伤组和TanA组，其中TanA组再分为2.5、5.0、10 mol/L三个浓度亚组。用100 nmol/L的A提前处理A+Glu损伤组细胞12 h，再加入5 mmol/L Glu处理24 h，TanA组将Glu和TanA同时加入处理24 h，倒置显微镜下观察形态学变化，MTT法观察细胞活力。其中空白对照组加等量的培养液代替。1.3.2 MTT法检测 取对数生长期的PC12细胞，使细胞密度约105个/ml，每孔100 l，