动物组织切片制作与染色

1、1水产动物组织切片的制作与染色水产动物组织切片的制作与染色2一、实验目的一、实验目的n学习石蜡切片法学习石蜡切片法n了解组织染色原理了解组织染色原理n掌握各组织器官的基本结构掌握各组织器官的基本结构3组织切片标本组织切片标本载玻片载玻片盖玻片盖玻片组织组织二、实验原理二、实验原理4二、实验原理二、实验原理5 根据不同的实验目的，选择相应的材料，材料要求根据不同的实验目的，选择相应的材料，材料要求新鲜、新鲜、准确、完整准确、完整，材料要避免挤压、挫伤、干枯。，材料要避免挤压、挫伤、干枯。n种类：种类：n部位：部位：肝肝n年龄或发育阶段年龄或发育阶段n是观察横切面还是纵切面？是观察横切面还是纵切面

2、？取材原则：取材原则：n动作动作-快，轻，用力均匀快，轻，用力均匀n体积合适：体积合适： 0.30.30.3 cmn刀要锋利刀要锋利n及时固定及时固定:编号编号, 注明采集时间、地点、名称、组织部位注明采集时间、地点、名称、组织部位6 取材后应及时固定，取材后应及时固定，编号，注明采集时间、地点、编号，注明采集时间、地点、名称、组织部位。名称、组织部位。n目的目的-保持原来的结构保持原来的结构n固定液：固定液：波恩氏液波恩氏液n固定时间：固定时间：48h左右左右n固定后的处理：固定后的处理：将固定液换成将固定液换成70%乙醇作短期保存乙醇作短期保存7n单一固定液单一固定液n复合固定液复合固定液

3、长处突出，短处抵消长处突出，短处抵消（Bouins） 8n保持组织新鲜，勿使其干燥，尽快固定处理。保持组织新鲜，勿使其干燥，尽快固定处理。n固定液必须有足够的量，一般大于组织固定液必须有足够的量，一般大于组织2020倍以上。倍以上。n组织块不易过大过厚，厚度必须控制在组织块不易过大过厚，厚度必须控制在0.3cm0.3cm以内。以内。n冲洗或漂洗：组织固定后应充分水洗，去除固定液造成的冲洗或漂洗：组织固定后应充分水洗，去除固定液造成的人为假象。人为假象。n抽气：使固定液尽快渗入材料内部，并排除材料内气泡的抽气：使固定液尽快渗入材料内部，并排除材料内气泡的干扰。干扰。9p水和透明剂不能互溶，只有脱

4、去水分后，才能让水和透明剂不能互溶，只有脱去水分后，才能让透明剂进入。现采用的脱水剂一般是透明剂进入。现采用的脱水剂一般是乙醇乙醇或丙酮。或丙酮。它既能与水相混合，又能与透明剂相混。它既能与水相混合，又能与透明剂相混。p脱水的过程：脱水的过程：70%80%90%70%80%90%（各（各1h1h） 95%95% 95%95%100%100%100%100%（各（各20min20min）p脱水的时间，可根据组织的类型，大小而定。脱水的时间，可根据组织的类型，大小而定。p保证脱水梯度和每一步脱水时间，水要完全脱净保证脱水梯度和每一步脱水时间，水要完全脱净，但不能过度脱水（过久使组织变脆，但不能过度

5、脱水（过久使组织变脆, , 收缩）收缩）10p二甲苯是使用最广泛的一种透明剂，它具有渗透二甲苯是使用最广泛的一种透明剂，它具有渗透力强，溶解石蜡量大，又易挥发的优点，其缺点力强，溶解石蜡量大，又易挥发的优点，其缺点是是易使组织收缩，变硬，变脆易使组织收缩，变硬，变脆，因此透明时间应，因此透明时间应根据组织块大小及质地酌情而定。根据组织块大小及质地酌情而定。p替代品：替代品：水杨酸甲酯（水杨酸甲酯（30min），氯仿等。，氯仿等。11p将完成透明步骤的组织块浸入透明剂与石蜡混合将完成透明步骤的组织块浸入透明剂与石蜡混合液中，不断提高石蜡的比例，直至用石蜡完全置液中，不断提高石蜡的比例，直至用石蜡

6、完全置换了组织块中的透明剂，使石蜡浸入组织而起支换了组织块中的透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用，便于今后的包理与切片（持作用，便于今后的包理与切片（1h1h）。）。p浸蜡应在高于石蜡熔点浸蜡应在高于石蜡熔点33左右的温箱左右的温箱（6060）中中进行，以利石蜡浸入组织内。进行，以利石蜡浸入组织内。12p将液态石蜡缓缓倒入将液态石蜡缓缓倒入金属模具金属模具中，再用镊子中，再用镊子轻轻将浸好蜡的组织块夹入轻轻将浸好蜡的组织块夹入金属模具金属模具，摆好，摆好位置，待石蜡冷却成固态即包埋完毕（位置，待石蜡冷却成固态即包埋完毕（约约15 15 minmin）。）。13n包埋好的蜡块用刀片修包埋好的蜡块

7、用刀片修成规整的方形或长方形，成规整的方形或长方形，附于小木块上附于小木块上n通常切片厚度为通常切片厚度为5 56um6um切切出一片接一片的蜡带，用出一片接一片的蜡带，用毛笔轻托轻放在纸上。毛笔轻托轻放在纸上。14n用粘附剂将展平的蜡片牢附于载玻片上，以免在用粘附剂将展平的蜡片牢附于载玻片上，以免在以后操作中使材料脱落。以后操作中使材料脱落。n在载玻片上涂抹粘片剂，再滴蒸馏水，放上蜡片在载玻片上涂抹粘片剂，再滴蒸馏水，放上蜡片铺展，最后用滤纸吸除多余水分，将载玻片放入铺展，最后用滤纸吸除多余水分，将载玻片放入4545温箱中干燥。温箱中干燥。15碱性染料，使细胞核等呈碱性染料，使细胞核等呈紫蓝

8、色紫蓝色嗜碱性嗜碱性酸性染料，使一般胞质和胶酸性染料，使一般胞质和胶原纤维呈粉红色原纤维呈粉红色 嗜酸性嗜酸性苏木精（苏木精（hematoxylin）伊红（伊红（eosin）1617n染色后的切片尚不能在显微镜下观察，需经梯染色后的切片尚不能在显微镜下观察，需经梯度酒精脱水，在度酒精脱水，在9595及纯酒精中的时间可适当及纯酒精中的时间可适当加长以保证脱水彻底；如染液为酒精配制，则加长以保证脱水彻底；如染液为酒精配制，则应缩短在酒精中的时间，以免脱色。应缩短在酒精中的时间，以免脱色。n二甲苯透明后，滴加适量（二甲苯透明后，滴加适量（1 12 2滴）中性树胶，滴）中性树胶，再将洁净盖玻片倾斜放下

9、，以免出现气泡。再将洁净盖玻片倾斜放下，以免出现气泡。18三、实验主要仪器三、实验主要仪器切片机烤片机摊片机19四、实验试剂四、实验试剂nBouin氏液：氏液：饱和苦味酸饱和苦味酸 75 ml,甲醛甲醛 25 ml，冰乙酸，冰乙酸 5 ml。nEhrilich氏酸性苏木素液氏酸性苏木素液：苏木素：苏木素 2 g，纯酒精，纯酒精 100 ml，钾明矾钾明矾 15 g，蒸馏水，蒸馏水 100 ml，甘油，甘油 100 ml，冰醋酸，冰醋酸 10 mln1%伊红染液伊红染液：中性曙红：中性曙红 0.51 g，蒸馏水，蒸馏水 100 ml n1%盐酸盐酸-酒精分化液酒精分化液：浓盐酸：浓盐酸 1 ml

10、，70%酒精酒精 99 ml 。n梯度酒精梯度酒精：70%乙醇、乙醇、80%乙醇、乙醇、90%乙醇、乙醇、95%乙乙醇、无水乙醇。醇、无水乙醇。n二甲苯二甲苯n石蜡石蜡n中性树胶中性树胶20五、实验步骤五、实验步骤（1）取材）取材21n取材取材固定固定（24-36 h）n70%乙醇（乙醇（1 h）n80%乙醇（乙醇（1 h）n90%乙醇（乙醇（1 h）n95%乙醇（乙醇（20min*2）n100%乙醇（乙醇（20min*2）n水杨酸甲酯水杨酸甲酯（约（约30min ）n1/2石蜡石蜡 + 1/2二甲二甲苯（苯（20min）n蜡杯蜡杯 （20min*2）n包埋包埋n切片切片n贴片贴片n烤片烤片（

11、2）脱水、透明、浸蜡、包埋、切片）脱水、透明、浸蜡、包埋、切片22（3）H.E.染色流程染色流程n二甲苯二甲苯脱蜡脱蜡（1）（）（10 min）n二甲苯脱蜡二甲苯脱蜡(2)（5 min）n1/2 100%乙醇乙醇 + 1/2 二甲二甲苯（苯（1）（）（3 min）n100%乙醇（乙醇（2 min）n95%乙醇（乙醇（2 min）n80%乙醇（乙醇（2 min）n70%乙醇（乙醇（2 min）n蒸馏水洗（蒸馏水洗（3 min）吸水吸水n苏木精染色苏木精染色（14min）n自来水洗（自来水洗（10min）n分化液分化液分化分化（3s）n自来水洗（自来水洗（35 min）n伊红染色伊红染色（1.5min）n70%乙醇乙醇 （2 min）n80%乙醇（乙醇（2 min）n 90%乙醇（乙醇（2 min）n95%乙醇乙醇 (1)(2)（2 min）n100%乙醇乙