【免费】代谢组学中代谢指纹分析技术进展

1、收稿日期:2008-04-17作者简介:孙向明(,女,黑龙江齐齐哈尔人,硕士研究生,研方向为中药化学及药动学T 36,x y 代谢组学中代谢指纹分析技术进展孙向明,杜娟,南莉莉(1.哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心;2.国家教育部抗肿瘤天然药物工程研究中心,黑龙江哈尔滨150076摘要:代谢组学主要考察生物体系受刺激或扰动后其内源性代谢产物的变化,从而研究生物体系的代谢途径。代谢指纹分析技术是代谢组学常用的研究手段之一。本文对代谢组学及代谢指纹分析技术的研究进展作相应的论述。关键词:代谢组学;分析技术;代谢指纹分析中图分类号:Q 493.1文献标识码:A文章编号:1672-979X (

2、200809-0062-04Pr ogr es s on M et abol i c Fi ngerpri nt i ng A nal ys i s i nM et abonom i csSU N X i ang -m i ng,D U Juan,N A N L i -l i(1.R esear ch C ent er o n L if e Sci ences and E nvir on m ental Sci ences,H ar b i n U niver si t y of C om m erce;2.E ngineeri ng R esear ch C ent er on N at u

3、 r al A nt icancer D r ug s of M i nist ry of E ducat ion,H ar b i n 150076,C hinaA bst r act :M et abo nom i cs m ainl y i nv esti gates t he change of end ogenous m et ab ol i smo f biol o gi cal systemthat i sst im u latedo r d i sturbed,an dstu diest h e m etab olic pat h w ay s of biolog ical s

4、yst em .M et ab oli c fing erp r inti n ganal y ti cal t echn i qu e i s one co m m on l y used study m ethod i n m etabon om ics.T his p aper r evi ew s the p r og r ess on m etabo nom i cs andm etab o l ic fing erp r intingan al y t ical techn iqu e.K ey w or ds :m et abon om i cs;an al y t i cal

5、tech ni q ue;m etab ol ic f inger pri nti n g anal y si s 1代谢组学简介1.1代谢组学的概念代谢组学是通过考察生物体系受刺激或扰动后(某个特定的基因变异或环境变化其代谢产物的变化或随时间的变化,是研究生物体系代谢途径的新技术1。N i c hol son 最初给出的定义是:定量测量生物体因病理生理刺激或基因改变引起的代谢应答变化2,3,系统性的代谢组学概念应将机体的代谢过程与微生物代谢以及外源环境因子的相互作用因素综合起来4。在其它文献的描述中还突出了代谢组学的时空动态性和全局性观点,体现了代谢组学与静态的代谢物组学的差别5。因此,代谢

6、组学是一个具有更广泛意义的系统生物学概念。严格地说,代谢物组是指某一生物或细胞所有的代谢产物(m e t a bol i t e 。在实际工作中由于分析手段的局限性,更多的人倾向于将代谢物组局限于某一生物或细胞中所有的低相对分子质量(M r代谢产物。与基因组学、转录组学和蛋白质组学相对应,代谢组学是一门对某一生物或细胞所有低M r 代谢产物进行定性和定量分析,以监测活细胞中化学变化的科学。研究过程中,逐步提出了一些相关概念,如代谢物靶目标分析(m et a bol i t e t ar ge t anal ys i s 、代谢轮廓(谱分析(m et a bol i c pr of i l i

7、ng ana l ysi s 、代谢组学(m et abonom i cs 或m et abol om i cs 和代谢指纹分析(m et a bol i c f i nger pr i nt i ng anal ysi s 。1.2代谢组学的技术平台代谢组学主要研究作为各种代谢路径的底物和产物的小分子代谢物(M r <1000。其样品主要是尿液、血浆或血清、唾液以及细胞和组织的提取液。研究大致分为3个阶段:样品制备,代谢产物检测、分析与鉴定以及后期数据分析和模型建立。与原有的各种组学技术只分析特定类型的物质不同,代谢组学所分析对象的大小、数量、官能团、挥发性、带电性、电迁移率、极性以及

8、其他物理化食品与药品Food and Drug 2008年第10卷第09期621984-el :179090094E -m ai l :sun i angm i ng2002a hoo.c n成为强有力的武器。高分辨核磁共振仪具有较好的灵敏度,信号分散,图谱容易解析,可检测的核素有1H ,13C ,15N ,19F ,23Na ,31P 和39K 等。新发展的高分辨魔角旋转(HR-M AS 、活体磁共振波谱(MRS 和磁共振成像(MRI 等技术能无创、整体、快速地获得机体某一指定活体部位的NMR 谱,直接鉴别和解析其中的化学成分。1H-N M R 和LC/NM R 成为代谢组学研究领域的最主要

9、分析技术之一。2.2质谱技术由于代谢组学关心的是M r<1000的代谢产物,相对于N M R 灵敏度低、检测动态范围窄等不足,现代质谱(MS 技术的优势是:(1超微量;(2快速(数分钟内完成1次测试;(3具有很高的灵敏度和专属性,可以同时快速分析多个化合物;(4能同时提供样品的M r 信息和结构信息;(5既可定量分析又可定性分析;(6能有效的与各种色谱法在线联用,成为分析复杂体系的有力手段。然而,M S 也存在离子化程度和基质干扰等问题。近年,随着质谱及其联用技术的发展,新一代M S 也开始在代谢组学研究和代谢通量分析中倍受青睐9-12。相关的M S 技术主要进展如下。2.2.1傅里叶变

10、换离子回旋共振技术(FT-I C R 由于准确鉴定复杂体系中未知标记物的结构仍是技术难点13,目前FT-I CR 质谱仪是质量解析度最高的质谱仪系统,具有超高分辨率和高准确度等突出的优点,并可以配备大气压电离(AP I 、纳升级电喷雾(na n o-ESI 和基质辅助激光解吸(M A LD I 等各种离子源,在代谢组学研究中将发挥更大的作用14。2.2.2直接输注大气压电离化质谱技术(D I M S 在代谢指纹的快速扫描中,除了常规的N M R 和分子振动光谱等方法外,D I M S 技术的应用日趋广泛15。2.2.3基于多孔硅表面的解吸离子化技术(D I O S 最近报道的电喷雾解吸电离(D

11、E S I 质谱技术(a m bi ent M S 16,17的突出特点是,在常压下能解吸电离表面吸附的分析物(无需样品前处理也不受基体背景干扰,从而实现原位、高通量、非破坏性的分析复杂样品,获得更直接和全面的样品信息。2.3色谱技术采用各种色谱整体性地分析复杂中药体系的次生代谢产物,还只是中医药现代化研究的起点。这种方法首次强调从整体和系统的角度看待中药,采用各种色谱高通量、整体性地分析复杂中药体系的次生代谢产物,即通过比较色谱指纹图谱的异同并进学参数差异很大,单一的分离分析手段往往难以保证无偏向的全面分析。色谱、质谱、核磁共振波谱、红外光谱、原子光谱、库仑分析、紫外吸收、荧光散射、发射性检

12、测和光散射等分离分析手段及其组合都应用于代谢组学的研究,一般根据样品的特性和实验目的,选择最合适的分析方法。目前最常用的分离分析手段是气相色谱和质谱联用(G C/MS ,液相色谱和质谱联用(L C/MS ,核磁共振(N MR 及傅里叶变换红外光谱与质谱联用(F T I R/MS 。2代谢指纹分析技术的进展代谢指纹分析系整体性地定性分析样品,比较图谱的差异快速鉴别和分类,而不分析或测量具体组分6。以下是目前常见的几种代谢指纹分析技术。2.1核磁共振技术1999年N i chol s on 2首次提出以N M R 分析为主的代谢组学研究模式,并联合国际6大制药公司启动了以创新药物安全评价和预测为主

13、要研究目的的CO M ET 计划,极大地推动了代谢组学在医药领域的应用和发展。N M R 是一种基于具有自旋性质的原子核在核外磁场作用下,吸收射频辐射而产生能级跃迁的谱学技术。20世纪70年代初N M R 开始应用于生物医学研究并得到迅速发展。利用高分辨率N M R技术检测完整器官或组织细胞内许多微量代谢组分,可得到相应的生物体代谢物信息。研究这些组分的NM R 图谱,综合分析这些信息反映的生物学意义,可以了解生物体代谢的规律,得出科学的结论,并可用于新药临床前安全性的评价。如D um a s 等7利用1H -13CH M BC-N M R 技术成功地检测分析了内源性物质的代谢产物。代谢组学中

14、NM R 方法的特点如下8:(1不破坏样品的结构和性质,无辐射损伤;(2可在一定的温度和缓冲液范围内选择实验条件,在接近生理条件下进行实验;(3可研究化学交换、扩散及内部运动等动力学过程,给出极其丰富的有关动态特性的信息;(4可设计多种编辑手段,实验方法灵活多样;(5无偏向性,对所有化合物的灵敏度是一样的。1H -N M R 的化学位移范围只有10ppm ,因此在35ppm 和68ppm 处有大量的氨基酸存在,图谱上可能出现上百个化合物的峰。这些峰相互重叠、干扰,造成图谱解析困难,生物标物(bi om ar ker 常受到与测定不相关物质的干扰,使N M R 难以发挥作用。高分辨核磁共振(N

15、M R 则食品与药品Food and Drug 2008年第10卷第09期63hi gh-r e sol ut i on行模式识别分析,以区分鉴定中药材并控制质量18,为理清中药复杂体系的化学基础打下了良好的基础。实际上,这本身就是一种代谢组学的研究方法19。全二维气相色谱(G C×G C是将分离机制不同且又相互独立的2根色谱柱以串联方式连接在一起。2根色谱柱之间装有1个起捕集再传送作用的调制器,将第1柱分离的组分由调制器聚集后以脉冲方式进入第2柱进一步分离,所有组分从第2根色谱柱进入检测器。G C×G C与G C相比具有高分辨率、高灵敏度、高峰容量等优点。袁凯龙等20建立

16、了一种基于尿中有机酸的SPM E(自动固相微萃取/G C×G C-FI D指纹图谱分析方法,通过尿样直接衍生后固相微提取,再行G C×G C-FI D分析,比较了G C×G C和G C的分离能力,证明G C×G C可用于研究疾病和药物作用于身体导致代谢异常的代谢指纹图。2.4分析技术联用通过包括色谱(G C、LC或毛细管电泳(CE在内的多维分离技术21,22,以及不同测定技术的联用23-26可做到分析平台的优势互补;此外,采用二维核磁共振(2D-N M R27可减弱复杂生物样品中大分子信号的干扰,提高小分子物质的检测能力。随着NM R技术的发展,以前用于

17、固体的魔角旋转(M AS技术也移植到了液体领域,用来研究以前难以用液体N M R研究的样品,如器官组织样品。利用M AS-N M R技术可以得到完整的组织样品高分辨谱图,扩展了代谢组学研究的样品范围,同时可以更全面深入地研究一个系统。M S与各种色谱技术联用使它在药物代谢组学的研究中扮演着十分重要的角色。Fi e hn等28用G C-M S从植物叶的提取物中自动匹配出326个化合物,然后用代谢轮廓鉴别4种不同基因型的植物。G C-M S 有很好的分离效率且相对较为经济,但需要对样品进行衍生化预处理,这一步骤会耗费额外的时间,甚至引起样品变化。受此限制,LC/M S中目前应用较广的是高效液相色谱

18、和质谱联用(HP LC-M S。H PLC与G C原理相似,但进样前不需衍生化处理,更适合于不稳定、难于衍生化、不易挥发和Mr较大的化合物。独特的优势使得LC/M S在药物代谢组学的研究领域中应用得日益广泛。M S的选择性和灵敏度都好于N MR。W a t er s公司率先采用先进的超高效液相色谱/高分辨飞行时间质谱技术(U PLC-TOFM S以及联机的M M Ly x自动化数据处理软件,为代谢组学研究提供了从样品分析到数据分析全过程的整体解决方案29。Pl um b等30,31用液相色谱和飞行时间质谱(LC-TOFM S联用技术,在事先不清楚受试药物结构的情况下检测了体液中的药物代谢产物,

19、结合化学计量学的方法对比分析给药样本与空白样本的谱图,在复杂谱峰中分出了代谢产物的质谱峰,避开了大量内源性物质的干扰。此外, H ar a da等32研制了一种非常适用于代谢分析的以毛细管电泳与质谱联用为基础的方法,此方法利用压力辅助毛细管电泳和电喷雾电离质谱(P A CE/ES I-M S,能同时分析磷酸糖、有机酸、核苷酸和辅酶A化合物等阴离子代谢产物。由此可见,多种分析技术联用在药物代谢组学的研究中起着多么重要的作用。3代谢指纹分析在代谢组学研究中的作用代谢组学研究的是细胞或生物样品所有代谢物的综合表现全局观点,通常采用绘图技术、现代分析测定方法(NM R,HP LC,M S以及计算技术和

20、统计方法,以高通量实验和大规模的计算为特征,最终完成“指纹图谱”。通过“代谢指纹图谱”不仅研究药物本身的代谢变化,而且研究药物引起的内源性代谢物的变化,更直接地反映了体内生物化学过程和状态的变化,阐明药物作用靶点或受体。通过检测一系列样品的谱图,再结合化学模式识别方法,可以判断生物体的病理生理状态、基因的功能、药物的毒性和药效等,并有可能找出与之相关的生物标志物。参考文献1N ichol son J K,C o nnel ly J,L i n don J C,et al.M et abonom i cs:a pl at f or m f or studyi ngdr ugt oxi ci ty

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