PAGE凝胶电泳银染方法的改进_图文

1、PAGE凝胶电泳银染方法的改进张金成,梁永文,范丽娜,廖和荣(石河子大学动物科技学院,石河子832003摘要:为改良DNA聚丙烯凝胶电泳(PA GE银染方法,采用PCR方法扩增鸡基因组微卫星DNA序列后,经PA GE分离扩增产物和pBR322DNA/BsuRI标准分子质量,利用2种银染法对微卫星位点进行检测,分析其灵敏度和可行性。结果表明,2种方法都能染出Marker的所有条带,灵敏度均为25ng,但在染色所需时间和可操作性方面,改进的染色方法优于San2 guinetti等所建立的方法。改进的银染方法染色过程较快,仅需25min左右,且染色液和显影液可回收利用。该方法能显著提高检测分辨率,在

2、实际应用中提高了染色效率。关键词:微卫星;聚丙烯酰胺凝胶电泳;银染中图分类号:Q789文献标识码:B文章编号:167127236(20090720099203微卫星序列(micro satellite DNA,MS,又称简单序列重复(simple sequence repeat,SSR、短串联重复序列(short tandem repeat,STR或简单序列长度多态性(simple sequence polymorp hism,SS2 L P,是广泛分布于真核生物基因组中的高度重复序列,已成为目前动植物遗传连锁分析、基因定位及饱和遗传标记图构建等极为重要的一种研究手段。微卫星的PCR扩增产物经

3、聚丙烯凝胶电泳分离后,目标产物的检测主要方法是通过显色法,且目前大多采用同位素放射自显影法、荧光染料标记法、溴化乙锭和银染法。银染法因其独特的优点,如试验成本较低,所用试剂安全稳定,银染后的PCR产物还可以回收,重新用于扩增,在目前的分子生物学研究中广泛应用。银染法基本原理是先用固定液将核酸固定到凝胶上,然后使染色剂中的银离子与之牢固结合,再通过还原剂将银离子还原,从而发生显色反应,使得目标产物凭肉眼即能观察列。尽管文献报道的银染方法很多,但具体操作耗时耗力,使初次使用者难以从中做出最佳选择。本试验对染色方法加以改进,旨在为试验者优化染色过程,最终建立一种切实可行优化的银染方法,在大幅度缩短染

4、色时间的同时,可有效控制凝胶的染色背景,步骤简单收稿日期:2009201208作者简介:张金成(1981-,男,河北人,硕士,研究方向:分子遗传学。通信作者:廖和荣(1959-,男,四川人,教授,博士生,从事动物遗传育种的教学与研究。Tel:0993*,E2mail:liaoherong基金项目:国家自然科学基金项目(30560101;石河子大学大学生研究训练计划项目(SRP0714243。易行。利用建立的改进银染法,对鸡微卫星DNA 扩增产物和pBR322DNA/BsuRI标准分子质量进行染色分离,取得了十分满意的效果。现报告如下。1材料与方法1.1材料1.1.1样本采用ACD抗凝剂(体积比

5、11抗凝,吸取ACD抗凝剂1mL于5mL一次性注射器中,从鸡的翅膀静脉采血1mL,上下颠倒3次以上,转移到已灭菌的1.5mL Eppendorf管中,置冰盒内带回实验室,-20冰箱保存,以备提取DNA用。1.1.2主要仪器与设备PCR扩增仪(P TC2 100TM型和凝胶成像系统均为美国B IORAD公司生产;台式高速离心机(Anke T G L216B型,为上海安亭仪器厂生产;水平摇床(WD29405B型, D YY25稳压稳流电泳仪,D YY2III型垂直电泳槽,均为北京市六一仪器厂生产。1.1.3主要试剂三羟甲基氨基甲烷(Tris购于北京赛百盛基因技术有限公司;琼脂糖(Agrose购于德

6、国Q IA GEN公司;丙烯酰胺(Acrylamide(BBI 公司;甲叉双丙烯酰胺(Bis2Acrylamide(AM2 RESCO公司;四甲基乙二胺(TEM ED(上海生工生物工程技术服务有限公司;甲醛(HCHO(天津市巴斯夫化工有限公司;银染所用其它试剂(分析纯试剂来源于石河子大学设备科。1.1.4微卫星引物根据国内外相关研究结果,从家鸡的1号染色体筛选出15对微卫星引物用于扩增,引物由上海生工生物工程技术服务有限公司(Sangon合成,并按合成说明稀释引物。1.2方法1.2.1基因组DNA的提取参照分子克隆实验指南的方法,并稍作修改,提取全血DNA,DNA血99中国畜牧兽医2009年第

7、36卷第7期生物技术样溶于TE 中,用0.8%的琼脂糖电泳检测,选取亮度较大,且无拖尾条带(图1,置4冰箱备用 。图1部分基因组DNA 检测结果1.2.2微卫星DNA 扩增的反应体系及反应程序PCR 反应总体积为25L :50ng/L DNA 模板1L ,10buffer 2.5L ,10mol/L dN TP 0.5L ,5p mol/L 引物各1.0L ,2.5U/L T aq 酶(含Mg 2+0.25L ,灭菌超纯水补至25L 。上下颠倒混匀,短暂离心,进行PCR 。PCR 扩增程序:94预变性5min ;94变性45s ,退火(526945s ,72延伸45s ,30个循环;72延伸1

8、0min ,4保存备用。PCR 产物以1.5%琼脂糖电泳检测,并用10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。试验采用pBR322DNA/BsuRI (Hae 标准分子质量作为对照。1.2.310%非变性PA GE 凝胶配制及电泳先将30%ACR/B IS 10.2mL ,5TB E 6mL ,超纯水14.56mL 混合,玻璃棒搅拌2min ,再加入10%A PS225L ,TEM ED 15L ,玻璃棒搅拌5min ,迅速将凝胶倒入预先做好的玻璃板之间,确保凝胶无气泡产生,无泄漏。静置45min 左右,制成200mm 150mm 3mm 的凝胶。在上、下电泳槽中各加入适量的0.5TB E 电泳缓冲液

9、,溴酚蓝2L ,PCR 产物8L 混合后上样,在25180V 稳定电压下电泳3h 。1.2.42种染色方法对比2种银染方法的程序见表1。表12种银染方法对比方法Sanguinetti 方法改进方法固定乙醇10%;乙酸0.5%;15min -洗脱去离子水2次,每次20s-银染乙醇10%,乙酸0.5%,硝酸银2g/L 混合贮存液,30min乙醇10%,乙酸0.5%,硝酸银2.5g/L 混合贮存液,15min洗脱去离子水,2min蒸馏水快洗2次,每次20s显影氢氧化钠3%,37%甲醛0.5%;混合贮存液;10min氢氧化钠3%,37%甲醛1%;混合贮存液;58min洗脱去离子水2次,每次20s-终止

10、乙醇10%,乙酸0.5%;5min 去离子水蒸馏水快洗2次,每次30s2结果通过15对微卫星引物,490份DNA 样,重复2次试验摸索和验证,总结出了简单易行、操作快捷的微卫星PA GE 银染改进方法。图2是2种银染方法凝胶成像结果,可见2种方法DNA 目的条带一致。改进后的凝胶DNA 目的条带清晰,易于判读基因型,证明此方法是一种简便快速的染色方法。3讨论银染法至今已有多种方法,其中应用最广泛的是Bassam 法和Sanguinetti 法。两方法各有所长,前者银染过程各项试剂都可重复使用,节约成本,并且时间短,15min 即可完成,很适合大量材料或重复性多的检测;后者的优点是背景淡、透明度

11、好,条带清晰,利于拍照做图片,但银染过程各步骤对时间控制的要求较高。本试验对Sanguinetti 所建立的强碱法的条件进行了优化,既节约成本,缩短时间,又有更高的灵敏度。改进的染色方法中,直接将固定和染色液两步合二为一,王凤格等(2004也曾报道,这种方法省略了洗脱操作,完成染色后,只需将染色液洗净,直接进行显影,大大简化了操作 。调整硝酸银和甲醛浓图2S anguinetti 方法(A 和改进方法(B 凝胶染色结果比较注:图A 和B 中1、2分别为同一PCR 扩增产物,M 均为pBR322DNA/BsuRI (Hae 。001生物技术中国畜牧兽医2009年第36卷第7期度均可以有效控制染色

12、时间。其溶液中的银离子可与核苷酸中带负电的磷酸基团共价结合,并在碱性环境条件下,由甲醛还原成黑褐色的金属银沉积于胶中而显示DNA 带型。硝酸银量不足会使DNA 带变浅,失效则导致胶板变空白,染色液与显影液混合也不会变棕黑色;量过多,导致嵌入或残留在胶板上的银离子增多,甲醛相对浓度减弱,在增加背景颜色的同时影响DNA 带的显影。李西平等(2004已经报道,0.2%硝酸银比0.1%硝酸银DNA 带型显色更深、更快,灵敏度更高。在碱性溶液中甲醛溶液将银离子还原为金属银而显色。当甲醛浓度超过1.5%(体积比,下同时,染色时间缩短,但胶颜色时间短易变黄,背景污浊,且相互反差变小,使不同分子质量的DNA

13、不能同步显色,影响灵敏度;浓度较低不仅使染色时间延长且不易着色。不同浓度(0.1%、0.15%、0.2%的甲醛,显色差异不大。而调整甲醛浓度到提高0.8%时,可以极大地缩短显色时间,染色仅需要5min 左右。双蒸水在银染中主要起清洗作用,包括清洗固定液、染色液及显影后的停显液(即为固定液,其中清洗固定液3次、停显液1次,每次2min ,时间稍长对染色结果影响不大;而染色后水清洗所用的时间十分重要,一般用10s 左右的时间将整个胶板冲洗一遍,然后进行显影。洗的时间过长则影响下一步显影,背景加深,DNA 带不清晰;过短则不能很好清洗掉胶上面的硝酸银残留物。另外,温度也影响银染效果,显色温度412时

14、,显色效果好,反应易于控制。采用改进的银染法染色,应注意以下问题:重复使用染色液后,要及时倒回各自的试剂瓶,重复使用一般不超过3次,染色液应保存在棕色瓶中。显影液应及时更换,避免黑褐色沉淀氧化银银颗粒沉积于凝胶表面,使背景颜色加深从而影响灵敏度。染色用容器要分开。最好做到用固定的染色容器分别盛染色液和显色液,每次使用之前冲洗2遍,使用之后应冲洗干净,倒扣在试验台上;转移凝胶用的玻璃棒每次使用之前都应用水冲洗干净。在染色过程中切忌用手直接接触凝胶。移胶时,玻璃棒应从凝胶的中央穿过,同时应用另一只手小心辅助,防止凝胶滑落;转移的凝胶应平铺,正面朝上,便于观察染色过程和记录样本结果,液体量以完全淹没

15、凝胶为宜;加入显影液的显色环节,试验者不可离开试验台,应仔细观察染色过程。根据凝胶的背景和目标条带的深浅,及时终止显色过程同时照相。如果凝胶在显液中存放时间超过30min ,可能增加很多杂带,不利于DNA 条带判型分析。对于染色结束的条带,需要过夜保存,可用蒸馏水完全浸没,置于4冰箱保存。当保存时间超过24h 之后其韧性一般较差。参考文献1王凤格,赵久然,郭景伦,等.一种改进的玉米SSR 标记的PA GE/快速银染检测新方法J .生物技术学报,2004,12(5:606607.2刘耘,熊家军,杨利国.2种方法银染的A FL P 片段再扩增效果比较及改进J .华中农业大学学报,2008(2:18

16、2185.3霍金龙,曾嵘,潘伟荣.微卫星PCR 聚丙烯酰胺凝胶银染法影响因素的分析研究J .云南农业大学学报,2005,20(1:1115.4Bassam B J ,et al.Fast and sensitive silver staining of DNA poly 2acrymid gelsJ .Anal Biochem ,1991,196(1:8083.5Sanguinetti C J ,Dias Neto E ,Simpson A J.Rapid silver stainingand recovery of PCR product s separated on polyacrylam

17、ide gels .Biotechniques ,1994,17(5:914921.Advanced T echnique for Silver Staining Methods onPolyacrylamide G els ElectrophoresisZHAN G Jin 2cheng ,L IAN G Y ong 2wen ,FAN Li 2na ,L IAO He 2rong(College of Animal Science and Technology ,Shihezi University ,Shihezi 832003,China Abstract :To study and

18、modify the optimal methods of silver staining of DNA polyacrylamide gels electrophoresis ,poly 2merase chain reaction (PCR 2polyacrylamide gel electrophoresis silver nitrate (AgNO 3staining were used to detect DNA f rag 2ments and pBR322Msp DNA molecular weight.2silver staining methods were analyzed and evaluated.The sensitivity of all the band of pBR322Msp Marker developed was coequally 25ng.However ,comparison of time and step ,advanced technique was more co