(食品科学)高效液相色谱_蒸发光散射法测定南瓜中果糖_葡萄糖

1、179分析检测食品科学2009, Vol. 30, No. 10高效液相色谱-蒸发光散射法测定南瓜中果糖、葡萄糖、及蔗糖含量王培培,孙爱玲,李爱峰,曾庆华,柳仁民*(聊城大学化学化工学院,山东 聊城 252059摘要:目的:建立简便、准确、灵敏的测定南瓜中果糖、葡萄糖及蔗糖含量的方法。方法:样品经热水提取后,使用Kromasil NH 2(250mm ×4.6mm ,5 m柱分离,以乙腈-水(80:20,V/V为流动相,使用蒸发光散射检测器检测。结果:果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖及乳糖的线性范围分别为0.53、0.755、0.55、110、110g/L ,检出限分别为1.90、2.40

2、、1.80 、2.50、2.60g/L ,样品的平均加标回收率分别为99.0%、97.1%、98.9%、99.5%、102.4%,相对标准偏差分别为1.02%、1.41% 、1.27%、1.72%、1.66%。市售5种南瓜中糖果、葡萄糖、蔗糖的实际测定结果分别为1.05%3.80%、0.823%4.49%、0.090%5.19%结论:该方法操作简便、快速、准确,用于实际样品的测定,结果令人满意。关键词:高效液相色谱-蒸发光散射检测法(HPLC-ELSD;南瓜;果糖;葡萄糖;蔗糖Determination of Fructoes, Glucose and Sucrose in Pumpkin b

3、y High Performance Liquid Chromatography-Evaporative Light Scattering DetectionWANG Pei-pei ,SUN Ai-ling ,LI Ai-feng ,ZENG Qing-hua ,LIU Ren-min*(College of Chemistry and Chemical Engineering, Liaocheng University, Liaocheng 252059, ChinaAbstract :Objective: To develop a simple, accurate and sensiti

4、ve method for determination of fructose, glucose, sucrose, maltose and lactose in pumpkin. Methods: The sugars in pumpkin were extracted with hot water, separated on Kromasil NH 2 column (250mm × 4.6 mm, 5 m using acetonitrile and water (80:20, V/V as the mobile phase, and examined using an eva

5、porative light scattering detector. Results: The linear ranges of fructose and glucose, sucrose, were maltose and lactose 0.5 to 3 g/L, 0.75 to 5 g/L, 0.5 to 5 g/L, 1 to 10 g/L and 1 to 10 g/L respectively. Their detection limits were 1.90, 2.40, 1.80, 2.50 and 2.60 g/L, respectively. The average sp

6、ike recoveries were 99.0%, 97.1%, 98.9%, 99.5% and 102.4%, respectively, and the relative standard deviations were 1.02%, 1.41%, 1.27%, respectively. The determination results of fructose, glucose and sucrose in five saled pumpkin samples were 1.05% to 3.80%, 0.823% to 4.49%, and 0.090% to 5.19%, re

7、spectively, while no maltose and lactose were found in these pumpkin samples. Conclusion: This method is simple, fast and accurate, and can be applied to the determination of fructose,glucose and sucrose in pumpkin with satisfactory results.Key words :high performance liquid chromatography-evaporati

8、ve light scattering detection (HPLC-ELSD;pumpkin ;fructose ;glucose ;sucrose中图分类号:O657.7 文献标识码:A 文章编号:1002-6630(200910-0179-03收稿日期:2008-07-08作者简介:王培培(1984-,女,硕士研究生,研究方向为分离科学。E-mail :wangpeipei0211 *通讯作者:柳仁民(1963-,男,教授,博士,研究方向为分离科学。E-mail :renminliu南瓜(Cucurbita spp是葫芦科南瓜属一年生蔓性草本植物,含有丰富的V E 、-胡萝卜素、南瓜多

9、糖、果胶、膳食纤维、瓜氨酸、环丙基氨基酸、微量元素铬、酶类、南瓜籽碱和葫芦巴碱及金属元素等功效成分,这使得南瓜表现出各种功能特性,可作为开发许多功能性食品的原料或作为功能性食品直接食用。我国古代就有对南瓜食疗保健作用的记载,在本草纲目中,李时珍将南瓜与灵芝放在一起,说它有“补中,补肝气,益心气,益肺气,益精气”的作用。近年来的研究亦表明,南瓜多糖有非常显著的降血糖作用,具有治疗糖尿病的功效1-3,因此南瓜作为一种防治糖尿病的营养保健食品倍受人们的重视4。南瓜中同2009, Vol. 30, No. 10食品科学分析检测180样含有水溶性的单糖及双糖,且不同品种、不同产地的南瓜中单糖含量不同,很

10、多糖尿病患者往往会误食大量的南瓜,造成病情的加重,所以建立一种准确、快速测定南瓜中单糖及双糖含量的方法很有必要。本研究首次采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法来测定南瓜中果糖、葡萄糖和蔗糖含量,以期为南瓜中这几种糖含量的测定提供一种准确、灵敏、快速的分析方法。1材料与方法1.1材料与试剂南瓜购于当地龙山菜市场。果糖、麦芽糖上海蓝季科技发展有限公司;葡萄糖天津市科密欧化学试剂开发中心;蔗糖天津市化学试剂三厂;乳糖天津市大茂化学试剂厂;各种糖标样均为分析纯纯度均大于99%;乙腈(色谱纯 山东禹王实业有限公司禹城化工厂;实验用水为二次重蒸水。1.2仪器与设备Unimicro HPLC泵、Unimicr

11、o色谱工作站通微(上海技术有限公司;Kromasil NH2色谱柱大连江申分离科学技术公司;Alltech ELSD2000ES蒸发光散射检测器美国奥泰公司;RE-3000旋转蒸发器上海亚荣生化仪器厂。1.3方法1.3.1色谱条件和ELSD参数Kromasil NH2色谱柱(250 mm×4.6 mm,5m;流动相:乙腈-水(80:20,V/V;流速1.5ml/min;柱温为室温;进样量20l。ELSD条件:漂移管温度为85;空气做载气;载气流速2.4L/m i n;分流阀状态:开。1.3.2样品溶液的制备南瓜去皮、去芯后,切碎、研磨,准确称取研磨后的南瓜5.000g,加入少量蒸馏水

12、,于95下提取2h,冷却,减压浓缩,定容至50m l容量瓶中。提取液先用干燥滤纸过滤,再用0.45m水系滤膜过滤,滤液供HPLC分析。2结果与分析2.1样品前处理条件的选择由于糖易溶于水,在室温下溶解度小,升高温度可以加速糖的溶出,但温度过高会使多糖、蔗糖等水解,故实验选择提取温度为95,在此温度下提取2h 可以使糖完全溶出。同时,还比较了不同提取方法得到的南瓜中糖的含量,发现超声提取效果不如热提,因此选取热提作为南瓜中糖的提取方法。2.2流动相的选择实验选择Kromasil NH2柱为分离柱,以乙腈-水为流动相考察了糖类化合物在氨基柱上的分离情况,结果表明,提高流动相中水的比例可以缩短分离时

13、间,但会使分离度下降,果糖与葡萄糖的峰部分重叠,而且水的比例过大会造成氨基柱的损伤;降低流动相中水的比例可以使分离度变大,但分离时间延长,峰展宽严重。综合考虑以上因素,当乙腈和水的体积比为80:20 (V/V,流速为1.5ml/min时,分离效果令人满意,在此条件下标准品与样品的色谱图如图1所示。2.3ELSD参数的选择图1五种糖标准品(A及南瓜样品(B的HPLC-ELSD色谱图Fig.1 HPLC-ELSD chromatograms of mixed five standard sugars(A and three sugars from pumpkin (B800600400200051

14、01520253035果糖mV时间(min葡萄糖蔗糖麦芽糖乳糖A6005004003002001000510*果糖mV时间(min葡萄糖蔗糖BELSD 检测器的参数主要有漂移管温度和载气流速。漂移管温度影响检测器的响应,温度低时流动相蒸发不完全,温度升高,流动相蒸发趋于完全,信噪比提高,但温度过高会使流动相沸腾,增加背景噪音,还可导致组分部分汽化,信号响应值变小,最优温度为在流动相基本蒸发完全的基础上,产生可以接受的噪音的最低温度,应根据流动相选择合适的漂移管温度。一般来说,载气流速越小,形成的溶质颗粒越大,散射光的强度越大,但是当载气流速太小时,流动相蒸发不完全,背景噪音大,最优的载气流速应

15、是在产生可接受噪音的基础上,产生最大响应值的最低流速。以推荐值为起点,逐渐改变漂移管温度或载气流速,观察基线噪音和响应信号的大小。结果发现,当漂移管温度为85,空气流速为2.4L/min,分流阀开时,噪音最小,响应信号最强,故确定此条件为最佳条件。2.4分流阀状态的选择181分析检测食品科学2009, Vol. 30, No. 10标准品线性范围(g/L回归方程相关系数最低检出限(g/L果糖0.53Y=1.534X+6.4060.9996 1.90葡萄糖0.755Y=1.273X+6.4410.9994 2.40蔗糖0.55Y=1.346X+6.4820.9982 1.80麦芽糖110Y=1.

16、406X+6.2280.9997 2.50乳糖110Y=1.344X+6.2700.99312.60表1果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖的回归方程、线性范围和检出限Table 1 Regression equations, linear ranges and detection limitsof fructose, glucose, sucrose, maltose and lactose.名称本底值(mg加入量(mg测得量(mg平均回收率(%RSD(%, n=5果糖109.250.4159.199.0 1.02葡萄糖117.549.9166.097.1 1.41蔗糖125.449.4174.

17、398.9 1.27麦芽糖050.249.9399.5 1.72乳糖50.051.20102.41.66表2果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖及乳糖的加标回收率Table 2 Spike recoveries of fructose, glucose, sucrose, maltoseand lactose实验所使用的ELSD2000ES 蒸发光检测器中带有分流阀装置,当分流阀处于“开”的位置时,气溶胶中较大液滴被旁路除去,使得漂移管温度在较低情况下就能使得流动相蒸发完全,因而样品能获得最佳检测灵敏度和基线稳定性。2.5线性关系考察配制一系列不同浓度的果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖的标准品混合溶液,

18、其中,果糖、葡萄糖、蔗糖的浓度分别为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0g /L ,麦芽糖、乳糖的浓度分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0g/L 。各取20l 进样分析,以峰面积的对数对溶液浓度的对数进行线性回归,得五种标准品的线性回归方程和相关系数,并以信噪比等于3为标准,测得五种糖的检出限,结果见表1。2.9回收率实验在已知糖含量的南瓜样品中分别取5份,准确加入已知量的果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖及乳糖标准溶液后,按照1.3.2的方法处理,在相同的色谱条件下平行测定5次,按照外标法定量并计算回收率,结果见表2。注:“”表示未检出。样品号果糖(%葡萄糖(%蔗糖(%麦芽糖(%乳糖(%1

19、 2.78 2.25 1.422 1.050.8230.0903 2.18 2.35 2.254 3.80 4.49 3.7552.713.535.19表3实际样品测定结果(%Table3 Determination results of fructose, glucose, sucrose,maltose and lactose in five saled pumpkin (%如表1所示,在线性范围内各种糖的含量与峰面积有很好的线性关系。2.6精密度实验配制果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖的混合对照品溶液,其中果糖、葡萄糖、蔗糖的浓度均为2.00g/L ,麦芽糖、乳糖的浓度均为6.00g/L 。连续进样5次,每次20l ,在上述色谱条件下分别测得峰面积,按照外标法定量计算各组分浓度的相对标准偏差(RSD分别为1.24%、1.03%、2.38%、0.824%和2.30%,表明该方法精密度良好。2.7稳定性实验取2.6中标准品供试液,每次20l 每隔4h 进样分析一次,分别测得果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖的峰面积,按照外标法定量,计算各组分浓度的R SD 值分别为3.87%、2.41%、0.423%