拮抗烟草黑胫病和赤星病的微生物菌剂应用研究试验方案1

1、微生物菌剂防治烟草黑胫病和赤星病试验方案本试验所用微生物菌剂含拮抗菌、解磷菌、解钾菌等多种有益微生物的复合微生物剂，能拮抗病原、活化和分解土壤中的磷与钾，具有壮苗、增产、抗病、抗旱等功能。通过烟草拮抗病效应简易对比试验达到提高减少农药施用，改良土壤,提高地力,保护环境的目的，为此,特制定本试验方案：一、微生物筛选方案的确立 （2011年1月2011年12月）根据防治对象不同，所选用的微生物的种类也不一样。为此应根据所要防治的目标样品进行菌种的筛选。制定了高效菌株的筛选方案。 1、高效微生物筛选 对微生物进行筛选和分离可以选出拮抗能力较强的微生物即优势菌，在土壤中或者叶围添加这些优势菌，可以在一

2、定程度上得以提高优势微生物拮抗作用。本项目对烟田土壤中、叶围的微生物进行了培养、驯化、分离、筛选实验，研究了pH、温度、底物浓度对微生物的影响，确定了菌种适宜的生长条件，筛选出的优势菌加入到土壤、叶围混合菌中，起到了一定程度的生物强化作用。 1.1 培养基 初筛培养基：牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号培养基和马铃薯培养基(PDA)。 复筛培养基：Ca( NO 3 )2 0.1g，K2H PO4 0.4g， KNO3 0.1g， MgSO4 ·7H2O 0.3g, FeC13 0.01g，土壤浸出液200 mL(取肥沃烟土200g，加水200 mL，煮沸1h，随时补充失去水分，过滤，滤液补

3、足200mL)，水800 mL。 1.2 盆栽试验基本材料 烟草品种为烟草黑胫病和赤星病易感品种；病土最好是烟草黑胫病发病田块连作烟田土，测定土壤有机质、全氮、 pH值、碱解氮、速效磷、速效钾等（为进一步分析所用）；化学肥料烟草专用肥。1.3 供试菌株来源 烟草黑胫病菌株、和赤星病菌株由发病烟株上自行分离得到。 2、复合菌剂的筛选与构建 2.1 营养菌系的分离与筛选 营养菌系的筛选原则是培养条件粗放，且能在土壤中快速繁殖，与拮抗菌系协同生长。从烟田、菜园、城市园林垃圾和堆肥中取样， 采用稀释分离法。取稀释度10-5、10-6和10-7各0.1mL在初筛培养基上涂平板，于4 0培养4872h，挑

4、取不同形态的单菌落，进行纯化。再将初筛得到的细菌、酵母制成密度为108 cfu/mL的菌悬液，霉菌和放线菌制成109 cfu/mL的孢子悬液，按3的接种量分别接种于装有140mL土壤浸出液培养基的250mL形瓶，于140 r/min，40培养4872h，选出长势旺盛的菌株。 2.2拮抗菌系的分离与筛选从烟草黑胫病发病烟田土中取根围和根际土壤，采用稀释分离法。取稀释度10-5、10-6和10-7。各0.1 mL在初筛培养基上涂平板，于30培养4872 h，挑取不同形态的单菌落进行纯化，土壤浸出液复筛后进行抑菌试验。 抑菌试验采用平板测定法。将复筛得到的营养菌和拮抗菌在对应 的平板培养基上涂布，3

5、0条件下培养4872 h，使其长满整个平板， 用打孔器制成直径为6mm的琼脂圆块。将培养基熔化后冷却到45左右，然后加入烟草黑胫病菌/赤星病菌作指示菌，摇匀后迅速倒人培养皿制成平板。待凝固后，每个平板等距离放入以上琼脂圆块，于 4静置12h，让琼脂里的次生代谢物质充分扩散到下层培养基。置 3 0培养箱培养48h，观察抑菌圈，选出抑菌圈直径大的菌株。 2.3 复合菌剂的构建 用以上平板测定法测定复选的营养菌系和拮抗菌系各菌种间两两拮抗作用，选出相互间无拮抗或拮抗作用较小的营养菌系和拮抗菌 系，将细菌、酵母制成密度为108 cfu·mL-1的菌悬液，霉菌和放线菌制成109cfu·

6、;mL-1的孢子悬液，按3的总接种量接种于装有140mL土壤浸出液培养基的250 mL锥形瓶，于140 r·min-1，35混合发酵 72 h，得到复合菌剂。发酵后其总含菌量不少于6.5×10cfu·mL-1。2.4温度和pH值对复合菌剂生长的影响按以上混合发酵工艺，用分光光度法(550 nm) 测定不同培养温度(25、30、35、40和50)对复合菌剂生长的影响。用0.1的HC1溶液和0.1的NaOH溶液将土壤浸出液培养基的pH值分 别调为3、4、5、6、7、8和9，用分光光度法(550 nm) 测定各pH值下复合菌剂生长。 2.5 复合菌剂对病菌的平板拮抗试验

7、将烟草黑胫病病菌/赤星病菌制成108cfu·mL菌悬液，吸取1 mL于培养皿，倒入20mL的营养培养基，摇匀。称取1g病土和研碎的病株的茎组织，加入装有100 mL灭菌的生理盐水的250 mL三角瓶 中，充分浸提后，稀释至105106倍，吸取各提取液1 mL于培养皿。每种提取液分别倒入20 mL的营养培养基和PDA培养基，摇匀。待培养基凝固后，每个平板等距离放入2个牛津杯，使其紧贴培养基表 面。各牛津杯均吸入0.2 mL复合菌剂。平板置4，12 h，让菌剂里 的物质充分扩散到下层培养基。置30培养箱培养48 h，记录抑菌圈直径。 2.6盆栽试验方法 试验设5个处理，每处理4个重复（处

8、理A：空白对照；处理B：施用常规药剂；处理C：接种病原、施生防菌剂同时进行；处理D：先施生防菌，10天接种病原；处理E：接种病原，过10天施生防菌）每处理设4个重复。每盆4 kg土壤。将化学肥料(烟草专用)作为基肥，与土壤混匀，再按以上处理将病菌液和复合菌剂一并混匀，倒入瓦盆。每天喷水保持土壤湿度在3050之间，让菌种活化1周后移栽已长4叶的烟苗，每盆2株，共8株。移栽15d、 34d后追肥两次。每次追肥，使所有处理氮、磷、钾的施入量相等，烟株生长期间观察并记录发病情况。必须高度重视，安排专人负责，整个试验过程要有观察记载，确保试验数据及总结真实可靠。二、田间试验（2012年1月2012年12

9、月）1、实施单位：曲靖烟草公司、云南农业大学、云南大学。2、试验地点的选择：选择有种烟经验、学科学用科技的种烟致富带头人为试验农户。田块选择在交通方便、地块平整、排水良好的方块田。田块面积在2亩左右。3、试验设计：试验设计5个处理。生防区（又分三种处理）、 药剂对照区和空白对照区5 个处理。每处理重复4次，对烟叶不同生育期进行复合菌剂处理。者海试验点生防试验示意图村庄（东北）保护行行1行2行3行4行5行6行7行8行9行10保护行各行前10株（作保护行） 区组各行前10株（作保护行） 区组处理A(50株)处理E(50株)处理C(50株)处理D(50株)处理B(50株)处理E(50株)处理D(50

10、株)处理C (50株)处理B(50株)处理A(50株)过道 区组过道 区组处理C(50株)处理B(50株)处理E(50株)处理A(50株)处理D(50株)处理E(50株)处理B(50株)处理D(50株)处理A(50株)处理C(50株)保护行备注：钢铁村第七村小组（海拔2060m，品种：红花大金元，前作： 移栽期： 常规施药： 施肥： ）本试验设5个处理，每处理4个重复（处理A：空白对照；处理B：施用常规药剂；处理C：接种病原、施生防菌剂同时进行；处理D：先施生防菌，10天接种病原；处理E：接种病原，过10天施生防菌）。田间不同生育期病害防治处理大田生育期药剂a（病毒病）药剂b（黑胫病）药剂c（野火病）药剂d（赤星病）1移栽期A移栽时和移栽后10天进行根部处理B. 同AC. 同A2团棵期A叶面喷施