12基因工程的基本操作程序

1、基因工程基本操作的四个步骤基因工程基本操作的四个步骤目的基因的目的基因的获取获取基因表达载体的基因表达载体的构建构建将目的基因将目的基因导入导入受体细胞受体细胞目的基因的目的基因的检测与鉴定检测与鉴定一、目的基因的获取一、目的基因的获取基因文库基因文库: : 将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNADNA片段片段, ,导入导入受体菌受体菌的群体的群体中储存中储存, ,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因因, ,称为基因文库称为基因文库(gene library)(gene library)基因组文库基因组文库: : 基因文库中包含了一

2、种基因文库中包含了一种生物所有的基因生物所有的基因, ,这种基因文库这种基因文库叫做基因组文库叫做基因组文库. .部分基因文库部分基因文库: : 基因文库中包含了一种生物的基因文库中包含了一种生物的一部分基因一部分基因, ,这种基因文这种基因文库叫做部分基因文库库叫做部分基因文库. .基因组基因组文库与文库与部分基部分基因文库因文库的关系的关系DUCK179制作基因文库的构建模式图基因文库的构建模式图通过对受通过对受体菌的培体菌的培养而储存养而储存基因基因DUCK179制作依据：目的基因的有关信息。依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能基因在染色

3、体上的位置基因的功能基因在染色体上的位置 基因的转录产物基因的转录产物mRNAmRNA 基因翻译产物蛋白质等特性基因翻译产物蛋白质等特性基因组文库和部分基因组文库基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库文库)比较比较 概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是在生物，是在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 条件：条件：_、 _、_ (_ (做启动子做启动子) )、 _ _ 等等 前提条件：前提条件： 。原理：原理：_方式：以方式：以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增循环的次数）为扩增循环的次数）结果：结果：多聚酶链式反应多聚酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNA

4、DNA复制复制已知基因的核苷酸序列已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸一对引物一对引物TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶指数指数2 2n n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增4 4、利用、利用PCRPCR技术扩增技术扩增目的基因目的基因双链的解开双链的解开过程：过程：a a、DNADNA变性（变性（90-9690-96）：）：双链双链DNADNA模板在热作用下，模板在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、退火（复性、退火（复性55-6055-60）：）：系统温度降低，引物与系统温度降低，引物与DNADNA模板结合，形成局部模板结合

5、，形成局部_。 c c、延伸（、延伸（70-7570-75）：）：在在TaqTaq酶的作用下，从引物的酶的作用下，从引物的55端端33端延伸，合成端延伸，合成与模板互补的与模板互补的_。 氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因1.1.用一定的用一定的_切割切割 质粒，使其出现一个切质粒，使其出现一个切 口，露出口，露出_。2.2.用用_切断目切断目 的基因，使其产生的基因，使其产生_ _ _。3.3.将切下的目的基因片段插入将切下的目的基因片段插入质粒的质粒的_处，再加入适量处，再加入适量_，形成了一个重，形成了一个重组组DNA

6、DNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建 核心核心限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶相同相同质粒质粒DNADNA分子分子一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶处理限制酶处理同一种同一种4.4.过程过程: :5.5.基因表达载体的组成：基因表达载体的组成：复制原点复制原点+ +目的基因目的基因+ +启动子启动子+ +终止子终止子+ +标记基因标记基因启动子：启动子

7、：位于基因的首端的一位于基因的首端的一段特殊的段特殊的DNADNA片断，它是片断，它是RNARNA聚聚合酶识别和结合的部位，有了合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出它才能驱动基因转录出mRNAmRNA，最终获得蛋白质最终获得蛋白质终止子：终止子：位于基因的尾端的一位于基因的尾端的一段特殊的段特殊的DNADNA片断，能终止片断，能终止mRNAmRNA的转录的转录标记基因标记基因的作用是为了鉴别受的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选从而将有目的基因的细胞筛选出来出来农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法

8、三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞转化：转化： 目的基因进入目的基因进入_内，并且在受体细胞内，并且在受体细胞内维持内维持_和和_的过程。的过程。方法方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞显微注射法显微注射法感受态细胞感受态细胞受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达1 1、将目的基因导入植物细胞的方法：、将目的基因导入植物细胞的方法： 农杆菌转化法农杆菌转化法（1 1）农杆菌转化法）农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法农杆菌介绍农杆菌介绍:Ti质粒上有质粒上有T-D

9、NA,称为可转移的称为可转移的DNA,它可转移到受体细它可转移到受体细胞胞,并整合到受体细并整合到受体细胞染色体胞染色体DNA上上.2 2、将目的基因导入动物细胞、将目的基因导入动物细胞方法：显微注射法方法：显微注射法程序：程序：3 3、将目的基因导入微生物细胞、将目的基因导入微生物细胞原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少方法：方法： 目的基因表达载体提纯目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵）取卵（受精卵） 显微注射显微注射 受精卵受精卵 新性状动物新性状动物用用Ca2+处理细胞处理细胞 感受态细胞感受态细胞 表达载体与感受态表达载体与感受态细胞混合细

10、胞混合 感受感受态态细胞吸收细胞吸收DNA分子分子检测检测鉴定鉴定检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNADNA上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等过程过程:A.首先取出转基因生物的基因组首先取出转基因生物的基因组DNAB.用含目的基因的用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记片段用放射性同位素等作标记,以此做探针以此做探针C.使探针和转基因生物的基因组杂交使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出

11、杂交带若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体表明染色体已插入染色体DNA中中方法方法: : DNADNA分子杂交分子杂交方法方法: : 分分 子子 杂杂 交交方法方法: : 抗原抗体杂交抗原抗体杂交过程过程:用上述探针和转基因生物的用上述探针和转基因生物的mRNA杂交杂交,若出现杂若出现杂交带交带,表明目的基因转录出了表明目的基因转录出了Mrna.四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定检查是否成功检查是否成功DNADNA分子杂交示意图分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的采用一定的技术手段，将两种生物的DNADNA分子的单分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列

12、，链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。的单链。 1）以下说法正确的是）以下说法正确的是 （ ） A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运载体必须具备的条件之一是：具有多、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接个限制酶切点，以便与外源基因连接 D、基因控

13、制的性状都能在后代表现出来、基因控制的性状都能在后代表现出来C C2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是）不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制、能复制 （ ） B、有多个限制酶切点、有多个限制酶切点 C、具有标记基因、具有标记基因 D、它是环状、它是环状DNA3）有关基因工程的叙述中，错误的是）有关基因工程的叙述中，错误的是（ ） A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、 限制性内切酶用于目的基因的获得限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、 人工合成目的基因不用限制性内切酶人工合成目的基因不用限制性内切酶4）有关基因工程的叙述正确的是）有关基因工程的叙述正确的是 （ ） A、限制酶只在获得目的基因时才用、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体、质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供