第七章分子发光分析法ppt课件

1、第七章第七章 分子发光分析法分子发光分析法molecular luminescenceanalysisv第一次记录荧光现象的是第一次记录荧光现象的是16世纪西班牙的内科医生和植物学家世纪西班牙的内科医生和植物学家N.Monardes，1575年他提到在含有一种称为年他提到在含有一种称为“Lignum Nephriticum的木头切片的水溶液中，呈现了极为可爱的天蓝的木头切片的水溶液中，呈现了极为可爱的天蓝色。色。v直到直到1852年，年，Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光光在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光光度计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍微长些，才判断这度计观察到其荧光的波

2、长比入射光的波长稍微长些，才判断这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光，而不种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光，而不是由光的漫射作用所引起的，从而导入了荧光是光发射的概念，是由光的漫射作用所引起的，从而导入了荧光是光发射的概念，他还由发荧光的矿石他还由发荧光的矿石“萤石推演而提出萤石推演而提出“荧光这一术语。荧光这一术语。v1867年，年，Goppelsroder进行了历史上首次的荧光分析工作，应进行了历史上首次的荧光分析工作，应用铝用铝桑色素配合物的荧光进行铝的测定。桑色素配合物的荧光进行铝的测定。v19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到世纪以前，荧光的观察是

3、靠肉眼进行的，直到1928年，才由年，才由Jette和和West提出了第一台荧光计。提出了第一台荧光计。某些物质的分子吸收一定能量后，电子从基态跃迁到激发态，某些物质的分子吸收一定能量后，电子从基态跃迁到激发态，以光辐射的形式从激发态回到基态，这种现象称为分子发以光辐射的形式从激发态回到基态，这种现象称为分子发光，在此基础上建立起来的分析方法为分子发光分析法光，在此基础上建立起来的分析方法为分子发光分析法较高激发态较高激发态基基 态态吸收能吸收能量受激量受激光辐射光辐射退激退激分子在退激过程中以光辐射形式释放能量分子在退激过程中以光辐射形式释放能量v根据分子受激时所吸收能源及辐射光的根据分子受

4、激时所吸收能源及辐射光的机理不同分为以下几类：机理不同分为以下几类：v v 光致发光：以光能来激发而发光光致发光：以光能来激发而发光v v 电致发光：以电能来激发而发光电致发光：以电能来激发而发光荧光荧光灯灯v 生物发光：以生物体释放的能量激发而生物发光：以生物体释放的能量激发而发光发光v 化学发光：以化学反应能激发而发光化学发光：以化学反应能激发而发光荧光荧光荧光分析法荧光分析法磷光磷光磷光分析法磷光分析法一、荧光与磷光的产生过程一、荧光与磷光的产生过程 由分子结构理论，主要讨论荧光及磷光的产生机理由分子结构理论，主要讨论荧光及磷光的产生机理。1. 1. 分子能级与跃迁分子能级与跃迁 分子能

5、级比原子能级复杂；分子能级比原子能级复杂； 在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；在每个电子能级上，都存在振动、转动能级； 基态基态(S0)(S0)激发态激发态(S1(S1、S2S2、激发态振动能级、激发态振动能级) )：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位； 激发态激发态基态：多种途径和方式基态：多种途径和方式( (见能级图见能级图) )；速；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；度最快、激发态寿命最短的途径占优势； 第一、第二、第一、第二、电子激发单重态电子激发单重态 S1 S1 、S2 S2 ； 第一、第二、第一、第二、电子激发三重态电子激

6、发三重态 T1 T1 、 T2 T2 ；第一节第一节 分子发光分析法原理分子发光分析法原理2.2.电子激发态的多重度电子激发态的多重度 电子激发态的多重度：M=2S+1 S为电子自旋量子数的代数和(0或1)； 平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应单重态能级低； 大多数有机分子的基态处于单重态； 3.3.激发态激发态基态的能量传递途径基态的能量传递途径 电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；传递途径传递途径辐射跃迁荧光延迟荧光磷光内转换外转换系间跨越振动弛豫无辐射跃迁 激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发光强度相对

7、大；荧光：10-710 -9 s,第一激发单重态的最低振动能级基态；磷光：10-410s；第一激发三重态的最低振动能级基态；S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间跨越内转换振动弛豫能量l 2l 2l 1l 1l 3l 3 外转换l l 2 2T2内转换振动弛豫非辐射能量传递过程非辐射能量传递过程 振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10 -12 s10 -12 s。 内转换：同多重度电子能级中内转换：同多重度电子能级中

8、, ,等能级间的无辐射能级交换等能级间的无辐射能级交换。 通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。回第一激发单重态的最低振动能级。 外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；转移能量的非辐射跃迁； 外转换使荧光或磷光减弱或外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭猝灭”。系间跨越：不同多重态系间跨越：不同多重态, ,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。 改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋轨道耦合

9、进轨道耦合进行。行。辐射能量传递过程辐射能量传递过程 荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级基态（基态（ 多为多为 S1 S0S1 S0跃迁；跃迁； 10-710-710 -9 s 10 -9 s 发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长； 磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级基态（基态（ T1 S0T1 S0跃迁）；跃迁）； 电子由电子由S0S0进入进入T1T1的可能过程：（的可能过程：（ S0 T1S0 T1禁阻跃禁阻跃迁）迁） S0 S0 激发激

10、发振动弛豫振动弛豫内转换内转换系间跨越系间跨越振动弛豫振动弛豫 T1 T1 发光速度很慢：发光速度很慢： 10-410-4100 s 100 s 。 光照停止后，可持续一段时间。光照停止后，可持续一段时间。二、激发光谱与荧光二、激发光谱与荧光( (磷光磷光) )光谱光谱 荧光(磷光)：光致发光，照射光波长如何选择？1.荧光(磷光)的激发光谱曲线 固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线 （图中曲线I ） 。 激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大；2.2.荧光光谱荧光光谱( (或磷光光谱或磷光光谱) ) 固定激发光波长(选最大激发波长

11、), 化合物发射的荧光(或磷光) 强度与发射光波长关系曲线(图中曲线II或III)。200260320380440500560620荧光激发光谱荧光激发光谱荧光发射光谱荧光发射光谱磷光光谱磷光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱3.3.激发光谱与发射光谱的关系激发光谱与发射光谱的关系 a. Stokes a. Stokes位移位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。 b.b.发射光谱的形状与激发波长无关发射光谱的形状与激发波长无关

12、 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量，产生电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光。迁回到基态，产生波长一定的荧光。 c. c. 镜像规则镜像规则 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱与激发光谱形状通常荧光发射光谱与它的吸收光谱与激发光谱形状一样成镜像对称关系。一样成镜像对称关系。 镜像规则的解释 基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似； 基态上的零振动能级与第一激发态的二振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁也然。 2002503

13、00350400450500荧光激发光谱荧光激发光谱荧光发射光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱蒽的激发光谱和荧光光谱三、荧光的产生与分子结构的关系三、荧光的产生与分子结构的关系 1. 1.分子产生荧光必须具备的条件分子产生荧光必须具备的条件（1 1具有合适的结构；具有合适的结构；（2 2具有一定的荧光量子产率。具有一定的荧光量子产率。 荧光量子产率（荧光量子产率（）：）：吸收的光量子数发射的光量子数 荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射；2.化合物的结构与荧光（1跃迁类型：* 的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生；（2

14、共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移（3刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。（4取代基效应：芳环上有供电基，使荧光增强。芳环上被F、Cl、Br、I 取代后，使系间窜跃加强，磷光增强，荧光减弱。其荧光强度随卤素原子量增加而减弱，磷光相应增强，这种效应为重原子效应。N NN NCCOO-O-OCOCOO-O-OCH2OHCH3H3C四、影响荧光强度的因素四、影响荧光强度的因素 影响荧光强度的外部因素1.溶剂的影响 除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化；2.温

15、度的影响 荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几率增加。3. 溶液pH 对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；OHO_OHH+_pH1有有荧光荧光pH13无荧光无荧光OHO_无荧光无荧光有荧光有荧光另外，表面活性剂也会影响荧光强度和特性4.内滤光作用和自吸现象 自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。 内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；5.溶液荧光的猝灭荧光物质与溶剂或其它物质之间发生化学反应，或发生碰

16、撞后使荧光荧光物质与溶剂或其它物质之间发生化学反应，或发生碰撞后使荧光强度下降或荧光效率强度下降或荧光效率f 下降称为荧光猝灭。下降称为荧光猝灭。使荧光强度降低的物质称为荧光猝灭剂使荧光强度降低的物质称为荧光猝灭剂 氧分子及产生重原子效应的溴化物、碘化物等都是常见的荧光猝灭剂氧分子及产生重原子效应的溴化物、碘化物等都是常见的荧光猝灭剂碰撞猝灭碰撞猝灭 M +激激 M* M* + Q M + Q +热热静态猝灭静态猝灭自猝灭自猝灭荧光物质发射的荧光被荧光物质的基态分子所吸收，即自吸收荧光物质发射的荧光被荧光物质的基态分子所吸收，即自吸收现象。现象。一、仪器结构流程一、仪器结构流程 测量荧光的仪器

17、主要由四个部分组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。 特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 基本流程如图：基本流程如图：单色器：选择激发光波长的单色器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射光第一单色器和选择发射光( (丈丈量量) )波长的第二单色器；波长的第二单色器；光源：灯和高压汞灯，染料光源：灯和高压汞灯，染料激光器激光器( (可见与紫外区可见与紫外区) )检测器：光电倍增管。检测器：光电倍增管。第二节分子荧光与磷光分析法第二节分子荧光与磷光分析法1、光源、光源v激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的发射强度；适用波长范围宽发

18、射强度；适用波长范围宽v荧光光度计中，常使用卤钨灯作光源荧光光度计中，常使用卤钨灯作光源v荧光分光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯荧光分光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯应用最广泛的一种光应用最广泛的一种光源，可发射源，可发射250800nm很强的连续光源很强的连续光源2、单色器、单色器v荧光计用滤光片作单色器，荧光计只能用于定量荧光计用滤光片作单色器，荧光计只能用于定量分析，不能获得光谱分析，不能获得光谱v大多数荧光光度计一般采用两个光栅单色器，有大多数荧光光度计一般采用两个光栅单色器，有较高的分辨率，能扫描图谱，既可获得激发光谱，较高的分辨率，能扫描图谱，既可获得激发光谱，又可获得荧光光谱又可获得

19、荧光光谱v第一单色器作用：分离出所需要的激发光，选择第一单色器作用：分离出所需要的激发光，选择最佳激发波长最佳激发波长 ex ，用此激发光激发液池内的，用此激发光激发液池内的荧光物质荧光物质 exv第二单色器作用：滤掉一些杂散光和杂质所发射第二单色器作用：滤掉一些杂散光和杂质所发射的干扰光，用来选择测定用的荧光波长的干扰光，用来选择测定用的荧光波长 em。 在选定的在选定的 em 下测定荧光强度，定量分析下测定荧光强度，定量分析3、样品池、样品池v盛放测定溶液，通常是石英材料的方形池，四面盛放测定溶液，通常是石英材料的方形池，四面都透光，只能用手拿棱或最上边都透光，只能用手拿棱或最上边4、检测

20、器、检测器把光信号转化成电信号把光信号转化成电信号, 放大放大, 直接转成荧光强度直接转成荧光强度荧光的强度一般较弱，要求检测器有较高的灵敏度，荧光的强度一般较弱，要求检测器有较高的灵敏度，荧光光度计采用光电倍增管荧光光度计采用光电倍增管荧光分析比吸收光度法具有高得多的灵敏度，是因荧光分析比吸收光度法具有高得多的灵敏度，是因为荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光强为荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光强度可度可 大大提高荧光强度大大提高荧光强度5、读出装置、读出装置记录仪记录或打印机打印出结果，扫描激发光谱和记录仪记录或打印机打印出结果，扫描激发光谱和发射光谱发射光谱仪器光路图同步扫描技术

21、 根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的关系，同步扫描可分为固定波长差()和固定能量差及可变波长三种； 同步扫描技术可简化光谱，谱带变窄，减少光谱重叠，提高分辨率； 如图。 合适的可减少光谱重叠；酪氨酸和色氨酸的荧光激发光谱相似 ， 发 射 光 谱 严 重 重 叠 ， 但60nm时，只显示色氨酸的特征光谱，实现分别测定。可获得三维光谱图的仪器 可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧(磷)光光谱图激发光谱和荧光、磷光光谱激发光谱和荧光、磷光光谱v荧光和磷光均为光致发光，合适的激发光波长需根荧光和磷光均为光致发光，合适的激发光波长需根据激发光谱确定据激发光谱确定激发光谱是在固定荧光波长下，

22、激发光谱是在固定荧光波长下，测量荧光体的荧光强度随激发波长变化的光谱测量荧光体的荧光强度随激发波长变化的光谱I固定固定em 荧光波长荧光波长获得方法：先把第二单色器的波获得方法：先把第二单色器的波长固定，使测定的长固定，使测定的em不变，改不变，改变第一单色器波长，从变第一单色器波长，从200700 nm 扫描，让不同波长的光照在扫描，让不同波长的光照在荧光物质上，测定它的荧光强度，荧光物质上，测定它的荧光强度，以以I 为纵坐标，为纵坐标， ex为横坐标得为横坐标得左图，即荧光物质的激发光谱左图，即荧光物质的激发光谱I固定固定 ex 激发光波长激发光波长获得方法：先把第一获得方法：先把第一单色

23、器的波长固定，单色器的波长固定，使激发的使激发的ex不变，不变，改变第二单色器波长，改变第二单色器波长，让不同波长的光扫描，让不同波长的光扫描，测定它的发光强度，测定它的发光强度，以以I 为纵坐标，为纵坐标， em为横坐标得左图，即为横坐标得左图，即荧光物质的发射光谱荧光物质的发射光谱 从曲线上找出最大从曲线上找出最大的的 emv从图中看出从图中看出vl l磷磷 l l荧荧 l l激激图吸收峰荧光峰磷光峰200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 9000400800120016002000240028003200360040

24、0044004800 IFl l200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 90004008001200160020002400280032003600400044004800 IFl l200250300350400450500550600650700750800850900080016002400320040004800 IFl l磷光检测 荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有荧光发射的同时测量磷光。 测量方法：（1通常借助于荧光和磷光寿命的差别，采用磷光镜的装置将荧光隔开。（2采用脉冲光源和可控检测及时间分辨

25、技术。 室温测量时，不需要杜瓦瓶。二、荧光分析方法与应用二、荧光分析方法与应用1 1、 特点特点（1 1灵敏度高灵敏度高 分子发光分析法比吸收光度法高分子发光分析法比吸收光度法高2 24 4个数量个数量级级 检测下限：检测下限：0.10.10.10.1g/cm-3g/cm-3 相对灵敏度：相对灵敏度：0.05mol/L 0.05mol/L 奎宁硫酸氢盐的硫奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。酸溶液。（2 2选择性强选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；光谱；（3 3试样量少试样量少 缺点：应用范围小。缺点：应用范围小。2、方法、方法v荧光衍生法v荧光猝

26、灭法v敏化荧光法3 3、定量依据与方法、定量依据与方法(1)定量依据定量依据 荧光强度荧光强度 If正比于吸收的光量正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率和荧光量子效率 ： If = Ia 由朗伯由朗伯-比耳定律：比耳定律： Ia = I0(1-10- l c ) If = I0(1-10- l c ) = I0(1-e-2.3 l c ) 浓度很低时，将括号项近似处理后：浓度很低时，将括号项近似处理后： If = 2.3 I0 l c = Kc（2定量方法标准曲线法：标准曲线法： 配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未

27、知试样的荧光强度，在标准曲线线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度；上求出浓度；比较法：比较法： 在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较；较；4 4、荧光分析法的应用、荧光分析法的应用(1)(1)无机化合物的分析无机化合物的分析 与有机试剂配合物后测量；可测量约与有机试剂配合物后测量；可测量约6060多种元素。多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧

28、化氢采用催化荧光法铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；测定； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定； 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定(2)(2)生物与有机化合物的分析生物与有机化合物的分析1、低温磷光分析法、低温磷光分析法v低温磷光分析是将试样溶于有机溶剂中，在液氮温度77K条件下形成刚性玻璃状物后，测量磷光.这样，可减小分子间的碰撞，防止磷光猝灭.所用的溶剂应具备下列条件：v易于制备和提纯；v 能很好的溶解被分析物质；v 在77K温度下应有足够的粘度并能形成明净的刚性玻璃体；v 在所研究的光谱区背景要低，没有

29、明显的光吸收和光发射现象。三、磷光分析法的应用三、磷光分析法的应用低温磷光分析常用试剂低温磷光分析常用试剂溶剂及组成溶剂及组成混合比例（混合比例（V/V）使用温度使用温度乙醇异戊醇乙醚乙醇异戊醇乙醚（EPA）25577K异丙醇异戊醇乙醚异丙醇异戊醇乙醚25+577K乙醇甲醇碘乙（丙）乙醇甲醇碘乙（丙）烷烷164177K水乙二醇水乙二醇12123K150KEPA氯仿氯仿12177KEPA+碘甲烷（碘甲烷（IEPA）10+177K三乙醇胺三乙醇胺纯溶剂纯溶剂193K213K 2、室温磷光分析、室温磷光分析v低温磷光需要适当的低温条件，限制了它的应用及发展.室温磷光分析避免了低温条件，将试样固定在滤

30、纸、硅胶、氧化铝、玻璃纤维、淀粉、溴化钾等基体上，以增加其刚性，减少三重态的碰撞猝灭，增强磷光相对强度。v固体基质表面室温磷光分析v胶束稳定室温磷光分析v敏化室温磷光分析 3、室温磷光分析应用、室温磷光分析应用（1 1稠环芳烃分析稠环芳烃分析 采取固体表面室温磷光分析法快速灵敏测定稠采取固体表面室温磷光分析法快速灵敏测定稠环芳烃和杂环化合物致癌物质）环芳烃和杂环化合物致癌物质）（2 2农药、生物碱、植物生长激素的分析农药、生物碱、植物生长激素的分析 烟碱、降烟碱、新烟碱等分析烟碱、降烟碱、新烟碱等分析 检测限检测限0.01 0.01 g/cm3 g/cm3 （3 3药物分析和临床分析药物分析和

31、临床分析一、基本原理一、基本原理1. 1. 化学发光反应化学发光反应 在化学反应过程中，某些化合物接受能量在化学反应过程中，某些化合物接受能量而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光。的光。 A +B = C + DA +B = C + D* * D D* * D + h D + h（1 1能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物；化合物；（2 2化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当应能相当 E=170E=170300 kJ/mol300 kJ/

32、mol；位于可见光区；位于可见光区；（3 3发光持续时间较长，反应持续进行；发光持续时间较长，反应持续进行； 化学发光反应存在于生物体化学发光反应存在于生物体( (萤火虫、海洋发萤火虫、海洋发光生物光生物) )中，称生物发光中，称生物发光(bioluminescence)(bioluminescence)。第三节第三节 化学发光分析法化学发光分析法S0S1S0T1T2碰撞失活系间跨越内部转换磷光荧光Y*X化学激发光致发光非辐射跃迁YY2.2.化学发光效率化学发光效率化学效率：化学效率：emcecl参加反应的分子数发射光子的分子数参加反应分子数参加反应分子数激发态分子数激发态分子数 ce 发光效

33、率：发光效率：激发态分子数激发态分子数产生光子数产生光子数 em 时刻t 的化学发光强度(单位时间发射的光量子数)： tctIddclcl dc/dt 分析物参加反应的速率；3.3.化学发光强度与化学发光分析的依据化学发光强度与化学发光分析的依据 在化学发光分析中，被分析物相对于发光试剂小得多，对于一级动力学反应： cttcttIAttcl0cl0cldddd dc/dt =Kc； K 为反应速率常数。定量依据：（1在一定条件下，峰值光强度与被测物浓度成线性；（2在一定条件下，曲线下面积为发光总强度(S)，其与被测物浓度成线性：4.4.化学发光反应的类型化学发光反应的类型（1 1气相化学发光反

34、应气相化学发光反应a. a. 一氧化氮与一氧化氮与O3O3的发光反应的发光反应 NO + O3 NO2NO + O3 NO2* * NO2 NO2* * NO2 + h NO2 + h 发射的光谱范围：发射的光谱范围：600600875nm875nm，灵敏度，灵敏度1ng/cm31ng/cm3；b.b.氧原子与氧原子与SO2SO2、NONO、COCO的发光反应的发光反应 O3 O2 + O O3 O2 + O （1000 1000 C C石英管石英管中进行）中进行） SO2 + O + O SO2SO2 + O + O SO2* * + O2 + O2 SO2 SO2 * * SO2 SO2*

35、 * + h + h 最大发射波长：最大发射波长：200nm200nm；灵敏度；灵敏度1 ng/cm31 ng/cm3； O3 O2 + O （1000 C石英管中进行） NO + O NO2* NO2 * NO2 + h 发射光谱范围：4001400nm；灵敏度1ng/cm-3；氧原子与CO的发光反应： CO + O CO2* CO2 * CO2 + h 发射光谱范围：300500nm；灵敏度1ng/cm-3； 氧原子与氧原子与NO的发光反应：的发光反应：c. 乙烯与乙烯与O3的发光反应的发光反应 乙烯与乙烯与O3反应，生成激发态乙醛：反应，生成激发态乙醛： CH2O* CH2O + h 最

36、大发射波长：435nm；对O3的特效反应；线性响应范围1 ng/cm3 1g/cm3；（2 2火焰中的化学发光反应火焰中的化学发光反应 在富氢火焰中，也存在着很强的化学发光反应；a. 一氧化氮 NO + H HNO* HNO * HNO + h 发射光谱范围：660770nm； 最大发射波长：680nm； 在富氢火焰中： NO2 + 2H NO + H2O 该反应十分迅速。此法可用于测定空气中NOx的总量，可与GC联用，作为氮化合物的检测器。b.硫化物硫化物 挥发性硫化物SO2 、H2S 、CH3SH、 CH3SCH3等在富氢火焰中燃烧，产生很强的化学发光蓝色）： SO2 + 2H2 S +

37、2H2O S + S 2S2 * S2 * S2 + h 发射光谱范围：350460nm； 最大发射波长：384nm； 灵敏度： 0.2 ng/cm3； 发射光强度与硫化物浓度的平方成正比。（3 3液相中的化学发光反应液相中的化学发光反应 机理研究较多，在分析中应用最多；可测痕量的H2O2 、Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce、Hg、Th等。 应用最多的发光试剂：鲁米诺3-氨基苯二甲酰肼）； 化学发光反应效率：0.010. 05； 鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程： 该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应，利用这一现象可测定这些金属离子，包括Co，Cu，Ni，Cr，Fe，Ag，Au等

38、；某些金属离子对此反应有抑制效应也能实现对这些金属的检测，包括Ce，Hf等。5. 5. 化学与生物发光分析的应用化学与生物发光分析的应用（1） 该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用这该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用这一现象可间接测定这些金属离子。可测痕量的一现象可间接测定这些金属离子。可测痕量的Cu2+ 、Mn2+、Co2+、V4+、Fe2+、 Fe3+、 Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+等；等；某些金属离子对此反应有抑制效应也能实现对这些金属的检测某些金属离子对此反应有抑制效应也能实现对这些金属的检测，包括，包括Ce，Hf等。等。（2） 可检测低至可检测低至 10-9 mol/L 的的H2O2；