Notch信号通路相关基因的表达与涎腺腺样囊性癌转移的关系

1、Notch信号通路相关基因的表达与涎腺腺样囊性癌转移的关系         10-11-15 15:49:00     编辑：studa20                        作者：卢友光 佘林 林李嵩 张声 丁林灿 【摘要】&

2、#160; 目的 筛选与涎腺腺样囊性癌转移相关的Notch信号通路基因。 方法 对已构建的涎腺腺样囊性癌高低转移细胞株ACCM、ACC2基因表达谱进行生物信息学分析，在与Notch信号通路基因进行比对后，筛选出差异基因，通过荧光实时定量PCR技术对相关基因的表达差异进行初步验证。 结果 涎腺腺样囊性癌的表达谱中有46个基因与Notch信号通路有关。验证发现，Notch1,Notch2,Notch4，CHUK，FOXC1，FZD2，FZD3，GBP2和RUNX1在2个细胞株中的表达差别有统计学意义(P<0.05)，同时Notch1在发生转移的涎腺腺样囊性癌中的表达明显高于未发生转移的涎腺腺

3、样囊性癌（P<0.05）。 结论 Notch信号通路中的多个基因可能参与了涎腺腺样囊性癌的发生和发展；Notch1的表达与涎腺腺样囊性癌的发生、转移密切相关。 【关键词】  癌，腺样囊性； 涎腺肿瘤； 聚合酶链反应； 细胞，培养的； 基因表达； 信号传导涎腺腺样囊性癌是口腔唾液腺常见的恶性肿瘤之一，该肿瘤的恶性程度高，术后易于复发，患者预后较差。目前认为多种分子涉及该肿瘤的发生发展及转移，包括P53、P16、P27、MMPs等。Notch信号通路是一条古老的信号通路，相邻细胞通过Notch信号通路的传递，决定细胞的增殖或凋亡，它参与胚胎发育，T细胞的发育，以及维持造血干细胞自我

4、更新等。笔者采用第二代差异显示技术构建了涎腺腺样囊性癌高低转移细胞株的基因表达谱，通过生物信息学分析和半定量RTPCR，发现Notch基因家族4个成员在ACC2，ACCM 2个细胞株间存在表达差异1。本研究采用荧光定量PCR进一步验证Notch基因家族在这2个细胞株中表达的差异，分析Notch信号通路42个主要相关基因表达的变化，寻找与涎腺腺样囊性癌转移相关的基因。    1  材料与方法    1.1  材料  人涎腺腺样囊性癌高转移细胞株ACCM和低转移细胞株ACC2由上海交通大学医学院附属第九人民医

5、院口腔颌面外科肿瘤实验室惠赠。其中ACCM为ACC2经过裸鼠体内连续传代培养分离出的高转移细胞株。免疫组织化学标本为福建医科大学附属第一医院手术切除并经病理确诊为涎腺腺样囊性癌的肿瘤石蜡组织标本，其中发生转移者11例，未转移者14例。    1.2  主要试剂和仪器  Trizol试剂（美国Invitrogen公司）；Prime Script RT reagent Kit、SYBR Premix Ex Taq(日本TaKaRa公司)；Notch1兔多克隆抗体(美国Neomarker公司)；UltraSensitive SP超敏试剂盒、磷酸盐缓冲

6、液PBS、柠檬酸盐抗原修复液、加强型DAB显色试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司）。Mastercycler Gradient 5331 PCR仪(德国Eppendorf公司)；TP800荧光定量PCR仪(日本TaKaRa公司)；GeneSnap凝胶成像系统(英国SynGene公司)；石蜡自动包埋脱水机、连续切片机（德国Leica公司）。    1.3  筛选Notch信号通路相关基因  根据文献2构建的涎腺腺样囊性癌基因表达谱，进行生物信息学分析，使用图像分析软件测量出所有片段在凝胶上的迁移距离。SAS统计软件进行曲线拟合，找出最佳拟合曲线

7、，计算各片段bp值。根据拟合结果，以片断大小和所在“表达窗”作参数，按2%容许误差从数据库(Qbiogene Inc MPBiomedicals Inc公司)确定其所对应的基因，每个片段数据均与NCBI GeneBank直接链接，从而对涎腺腺样囊性癌的基因表达谱进行分析，初步得出相关基因。根据文献36查找Notch信号通路上下游相关基因共113个，通过与文献2构建的表达谱中所得到的5 420个基因片段的信息进行比对，选出在两者中共有的基因共46个，通过NCBI Genebank和UCSC查询46种基因的序列，使用Primer 3(v.0.4.0)在线设计引物（表1），引物委托上海生工生物工程技

8、术服务有限公司合成。    1.4  细胞株培养  将ACCM、ACC2细胞株复苏、传代、培养、取第4代对数生长期细胞通过Trizol法提取抽提RNA，用紫外分光光度仪检测RNA纯度和浓度。通过分光光度仪测定260 nm和表1  46种基因及内参照引物280 nm的值，两者比值在1.72.0，并根据260 nm将各个样品总RNA稀释至相同浓度，使用Prime Script RT reagent Kit逆转录试剂盒逆转录为cDNA。    1.5  荧光实时定量PCR分析  反应体系包括

9、：cDNA 2.0 L，上游引物0.5 L，下游引物0.5 L，SYBR Premix Ex Taq 12.5 L，去离子水加至总体积25 L。反应条件：94 30 s94 10 s60 30 s，进行40个循环后进行融解曲线的测定。以前12个循环的荧光值作为荧光本底信号，第412个循环的荧光信号的标准差的10倍设定为阈值，以Actin(ACTB)为管家基因，校正每个样品Ct值，数据分参照文献7的方法进行。46种基因均采用上述方法进行PCR反应，同时每个基因在每个模板中做3次重复实验，得到的Ct值取平均值Ct，对应模板内参基因（ACTB）Ct值的平均值 Ct(ACTB)：  

10、;  Ct=Ct-Ct(ACTB)；CtCt实验组-Ct对照组    对照组和实验组中待测基因的倍数：    N=2-Ct    1.6  免疫组织化学分析  标本取下后立即用10%福尔马林固定，常规石蜡包埋，3 m连续切片。阳性对照采用卵巢癌组织，阴性对照用磷酸盐缓冲液代替一抗。免疫组织化学验证采用SP三步法，由2位病理科医师盲法阅片，随机观察10个视野（×400）。评判标准：标本无阳性反应细胞或阳性反应细胞<10%为阴性（）；10%50%为阳性（+）；&g

11、t;50%为强阳性（）。    1.7  统计学处理  数据采用SPSS 14.0软件包处理。实时定量PCR结果采用两样本t检验，免疫组织化学结果采用秩和检验。=0.05为统计学检验标准。    2  结  果    2.1  PCR分析结果  对上述初筛的46种基因进行定量RTPCR分析，将对照组（ACC2）各个基因的相对表达量定义为1，ACCM细胞中这些基因的相对表达量见图1。与ACC2比较，在46个基因中，CHUK、FOXC1、FZD2、FZ