医学遗传学综合实验

1、第五章医学遗传学综合实验一、实验目的1掌握利用系谱与DNA 检测所得到的信息相结合用于产前基因诊断的方法；2了解 DNA 分析技术在遗传病产前基因诊断中的应。二、实验原理（一） PCR-RFLP 分析技术PCR-RFLP 分析技术是在PCR 技术基础上，根据限制性内切酶识别位点改变而导致的酶切位点增加或消失的特点，对DNA 进行鉴定；利用 PCR 特异扩增的DNA 片断中包含某个碱基突变，经特定限制酶切割后 , 通过凝胶电泳分离酶切产物大小，比较分析与对照样本的异同，判断该DNA 是否存在突变。应用PCR-RFLP 分析技术可以检测已知的点突变，也可以在家系中连锁分析进行基因诊断。（二） F基

2、因F基因位于人类染色体 Xq28 ，长 186kb ，由 26 个外显子及 25 个内含子组成。根据 F基因序列，本实验利用 PCR 结合 RFLP 设计了一对特异性引物， 首先扩增出 F基因长度为 142bp 的特异性片段，然后选择Bcl 限制性核酸内切酶对扩增产物进行消化，野生型基因拥有限制性核酸内切酶Bcl 的酶切位点， 可被切为99bp 和 43bp 两个片段；而突变型基因没有限制性核酸内切酶Bcl 的酶切位点，不会被Bcl 切断，酶解后仍为142bp 的片段；如果酶解后142bp、99bp 和 43bp片段均出现，说明是野生型基因与突变型基因的杂合子（图5-1 ，图5-2）。图 5-

3、1 PCR-RFLP 分析 F基因原理图图 5-2PCR-RFLP 分析 F基因结果示意（三）血友病A 病例姓名：李XX性别：男出生日期： 1979 年 5 月民族：汉现住址： XXXXXX就诊日期： 2000 年 7 月（ XX 医科大学XX 临床学院血液室）主诉：反复出血不止、关节肿痛15 年，加重1 年现病史： 15 年前，于轻微外伤后出血不止，外用凝血药止血后未予治疗。此后齿龈、舌、口腔、鼻经常出血，而膝、踝、肘等部位常于轻微外伤后出现淤斑、关节肿痛，症状逐年加重。查体：神志清楚，语言流利，贫血貌，膝、踝、肘关节僵硬变形，肌肉萎缩。实验室检查：凝血时间延长；凝血活酶时间显著延长；血浆中

4、抗血友病球蛋白减少；出血时间、 凝血酶源时间、 纤维蛋白原含量、毛细血管脆性及血小板数均正常。【注：血浆因子活性的正常均值定为100（范围 50 200）。甲型血友病血浆因子活性水平低于5，重型 2。】家族史： 家系中两个舅舅曾患类似病死亡，现有一同胞弟弟患有同病，同胞现年7 岁，已出现出血时间延长，出血不止症状。三、实验准备（材料、试剂、仪器）（一）试剂1模板 DNA （ 50ng/ l ）、引物和（ 20 ）、TaqDNA 聚合酶（ 5u/ l）、10XPCR 反应缓冲液、 dNTP（ 2.5mM ）、灭菌蒸馏水、矿物油、限制性内切酶Bcl ( 20 / l) 、 10X 酶切缓冲液。2

5、30%非变性聚丙烯酰胺凝胶（29 1）、5XTBE 、2%过硫酸铵、TEMED 、6X 上样缓冲液、DNA 分子量标记、 5mg/ml 溴化乙锭（ EB）染液、无水乙醇（三）仪器和设备PCR 自动热循环仪、紫外透射仪、微量加样器、枪头及离心管、容器盒、恒温水浴箱、制胶玻璃板、制胶架、聚丙烯酰胺凝胶电泳装置、 5ml 注射器、 12 号针头、 25 l 玻璃注射器、烧杯、脱脂棉、保鲜膜、染色盒、微波炉、 250ml 三角烧瓶、透明胶带、称药盘、天平。四、实验方法与步骤（一） PCR 反应PCR 反应体系 20 l ，其成分如下：模板 DNA2l10× PCR 缓冲液2 lTaqDNA

6、聚合酶0.2 l2.5mM dNTP1 l20 M Primer 0.5 l20 M Primer 0.5 lddH 2 O13.8 l总体积20 lPCR 反应循环温度： 95 变性 2min ，9440s；55 30；72 50 ，共 30 个循环，最后经 72延伸 5min ，反应结束后置 4冰箱保存（二） PCR 产物的 Bcl I 酶切反应体系 30 l其成分如下：PCR 扩增产物12l10X 酶解缓冲液3 lBcl I 限制酶1 lddH 2O14总体积30l置 50水浴消化 2 小时， 4保存。（三）聚丙烯酰胺凝胶电泳1制备 12%聚丙烯酰胺凝胶5 ml 。加 TEMED5 l

7、和 0.4ml 过硫酸铵， 混匀后灌胶， 插入加样梳子。 待胶完全凝聚后， 拔出加样梳子，安装电泳装置， 加入电泳缓冲液（ 1XTBE ），缓冲液应高于加样孔上缘，用注射器吸取缓冲液冲洗加样孔，预电泳20 分钟。2每份限制酶切产物取 10ul ，加 2ul 的 6X 载样缓冲液，混匀后加入到样品孔中，以 100V 电泳 50 分钟。3拆下电泳装置，取出聚丙烯酰胺凝胶，切去左上角，作好标记后放到一个朔料盘内，加EB染液染色3 分钟。4 EB染色以后取出凝胶，放在紫外透射仪中观察PCR-RFLP结果。五、注意事项1酶类试剂应保存在 以下，以免失活，如 TaqDNA 聚合酶、 Bcl I 限制酶。2聚丙烯酰胺和溴化乙锭（EB）是有毒的，需戴手套操作，避免污染。3每组有患者、 患者父母和胎儿DNA样本，分别进行PCR 扩增六、预期实验结果与分析根据