喉癌喉咽癌P-GP定量分析及临床意义

1、    喉癌喉咽癌P-GP定量分析及临床意义        内容提要应用流式细胞仪结合计算机辅助行数据、像分析,用荧光标记抗体(MDR1-PE,Clone UIL2)定量检测34例喉癌、喉咽癌组织和18例癌旁组织的P-GP含量,并与肿瘤病理、生物学特性进行比较分析,研究喉癌、喉咽癌细胞MDR1基因产物P-GP的表达及临床意义。结果显示,喉癌、喉咽癌P-GP阳性表达率为58.8%(2234);P-GP表达与喉癌、喉咽癌患者的临床分期无关(P0.05),与病理组织学分级及有无颈淋

2、巴结转移有关(P0.01)。提示P-GP检测有助于估计肿瘤的生物学特性;P-GP有可能成为有效的预后指标。关键词喉肿瘤;下咽肿瘤;抗药性;糖蛋白类;基因表达,流式细胞术中分类号R 739.65THE CLINICAL SIGNIFICANCE OF THE EXPRESSIONOF P-GPLCOPROTEIN( P-GP) IN LARYNGEALAND HYPOPHARYNGEAL CARCINOMALi Yong1Luan Xinyong2Zhang Ti2, et al (1 Shandong Overseas Hospital 2The Affiliated Hospital of

3、Shandong Medical University)AbstractQuantitative analysis and statistical image analysis of P-GP were made by Flow Cytometry and computer on 34 tumor tissues,18 tumor-adjacent tissues in the patients with laryngeal and hypopharyngeal squamous cell carcinoma (LSCC,HSCC) and 3 normal laryngeal tissues

4、,determined by MDR1-PE,cloneUIL2.Also the relationship between the expression of MDR1 and the clinical pathological characteristics of LSCC and HSCC were evaluated.The result revealed the rate of the positive expression of P-GP was 58.8%(22/34).It also showed no correlation between P-GP and clinical

5、 stages of tumors(P0.05), but there was significant correlation between pathological degree and matastases of cervical lymph nodes (P0.01). P-GP expression is probably a biological marker of prognostic value to LSCC and HSCC.Key wordsLaryngeal neoplasms;Hypoharyngeal neoplasms;Drug resistance;Glycop

6、roteins;Gene expression;Flow cytometry化学治疗对许多肿瘤细胞,特别是头颈部恶性肿瘤的效果较差,主要原因是肿瘤对化疗药物产生了耐药性。国内外学者对多药耐药(multidrug resistance,MDR)的研究,已进入临床阶段1,但有关喉癌,喉咽癌细胞多药耐药的研究报道尚少。我们用美国B-D公司生产的最新一代流式细胞仪(flow cytometry,FCM)对34例喉癌、喉咽癌细胞的多药耐药基因蛋白(P-Glycoprotion,P-GP)进行了定量检测,并研究其与肿瘤生物学特性的关系,以指导临床预测肿瘤的耐药性,制定合理的、个别化的治疗方案,为喉癌、喉咽

7、癌MDR现象的耐药逆转及肿瘤的化学药物基因治疗提供依据。1材料及方法1.1临床资料及材料1.1.1临床资料1998年9月到1999年2月在山东医科大学附属医院耳鼻咽喉科手术切除且经病理证实的喉癌、喉咽癌标本共34例,喉癌22例,喉咽癌12例,均为鳞状细胞癌;喉癌中12例带癌旁组织,喉咽癌中7例带癌旁组织。男28例,女6例,3879岁,平均54岁。除2例喉癌为手术加放疗后复发、1例喉咽癌放疗后复发外,余者术前均未经化疗、放疗或手术治疗。1.1.2材料荧光标记抗体MDR1-PE(单克隆抗体UIL2)及对照组鼠抗IgG2a(单克隆抗体U7.2),均为Immunotech公司提供。1.2实验方法1.2

8、.1瘤组织单细胞悬液的制备取新鲜肿瘤组织0.21.0g,用生理盐水洗去血迹后,置于重叠的100目铜网和260目尼龙网上用眼科剪剪成1mm3碎块,再用眼科镊夹持组织在铜网上轻搓,边搓边用磷酸盐缓冲液(PBS)将搓下的细胞洗入网下的平面皿内,直至组织搓完,将收集到的细胞悬液以260目网过滤1次以除去多余的组织碎块。收入100ml试管内离心(1500r/min,10min),弃去上清再用PBS2ml漂洗。同上述方法离心2次,均取上清,备用。1.2.2免疫标记标记前用PBS漂洗、离心1次(1500r/min),以除去固定剂。取1×106细胞ml加入荧光标记抗体(MDR1-PE)15l,放置避

9、光处作用30min,再用PBS洗涤2次,上机待检。1.2.3流式细胞仪检测FACS Vantage型流式细胞仪系美国B-D公司产。上机前用标准荧光微球调整仪器,使变异系数在2.0%以内。上机后收集20 000个细胞,荧光强度以对数放大,光散射数据存软盘,测试完后在Macintosh750型计算机上用Cell Quest Plot软件(B-D公司开发)分析数据,由HP-1200c/ps打印机打印结果,包括散点和组方。1.2.4统计学处理数据用±s表示,PU值指P170阳性细胞的百分数,P值由Fisher精确概率法计算,两均数差别显著性检测使用t检验。2结果2.1P-GP在喉癌、喉咽癌、

10、癌旁组织及正常组织中的表达P-GP在喉咽癌中阳性率为75%,含量范围为(6.38±3.12)%,喉癌中阳性率50%,含量范围为(5.77±3.08)%,癌旁组织含量范围为(0.93±0.47)%。见表1。表1P-GP在喉癌、喉咽癌、癌旁组织及正常组织中的表达nP170阳性细胞%喉癌225.72±3.08喉咽癌126.83±3.12癌旁组织190.93±0.47*P0.01 vs喉癌和喉咽癌2.2P-GP表达与喉癌、喉咽癌临床分期的关系因期病例较少,将、期作为1组,、期为1组;按分化程度分为高分化()和低分化()两组;无淋巴结转移组N0

11、与淋巴结转移组N1、N2、N3比较,结果表明,P-GP表达与患者的临床分期无关(P0.05),与肿瘤的病理组织学分级及颈部淋巴结转移有关(P0.01),见表2。 表2P-GP表达与喉癌喉咽癌生物学特性的关系nP170阳性细胞数%P值临床分期、85.47±2.730.05、266.16±3.11病理组织分级156.78±4.120.01194.03±3.10淋巴结转移N0153.02±1.870.01N1N3216.13±3.733讨论近年的研究发现,肿瘤产生耐药性与多种因素有关,如多药耐药基因(MDR1)的过度表达、多药耐药相关蛋白基

12、因(MRP)2和肺相关蛋白基因(LRP)3的异常表达、拓扑异构酶基因(TP)突变或表达减少、谷胱甘肽转移酶(GST)4表达的改变以及O6烷基脲嘌呤DNA多药烷基转移酶活性的改变有关。其中最重要的是多药耐药基因的过度表达及其编码产物P-GP增多。人的P-糖蛋白是MDR基因mdrl的编码产物,是一种跨膜蛋白质,有1280个氨基酸组成,总分子量为P170 180kd,又称P170,故测定P170可反映MDR基因的表达程度。自70年代中期Juliano和Limg5等首次发现仓鼠MDR细胞高度表达分子量约170kD的糖蛋白,并将其命名为糖蛋白P(P-GP)之后,学者们对临床肿瘤进行了大量的检测分析,发现

13、几乎所有的人类肿瘤中,MDR基因表达均有不同程度地升高。90年代以来,有关头颈部恶性肿瘤的MDR研究也有报道,但尚未见到有关喉癌、喉咽癌细胞中P-GP表达检测的报告。Kelley6(1993)最早用单克隆抗体UIL2检测了53例未经治疗的头颈部肿瘤的P170表达情况,P170阳性率高达69%(33/53);Pavelic7(1993)用4种单克隆抗体JSB-1、NYB241、C-219、UIL2分别检测了33例头颈部恶性肿瘤的表达,阳性率为61%(23/33);Rabkin8(1995)用单克隆抗体JSB1和C494检测了33例舌底鳞癌,全部标本均显示MDR1高表达;国内胡同华等9(1997)

14、用ABC免疫组化法(单抗JSB-1)对47例未经治疗的头颈部恶性肿瘤细胞进行检测,阳性率为57%(2741)。蔡晓岚10(1995)用RT-PCR技术测定了35例喉癌及25例喉咽癌MRP表达,阳性率分别为45.7%和52%。我们采用流式细胞术对34 例喉癌喉咽癌患者进行P-GP定量分析,阳性率为58.8%,国内外文献报道与本结果相似。80年代,以顺铂为基础的新化疗方案开始用于临床并取得了成功。一些初治病例经诱导化疗(ICT)后,肿瘤得到部分或完全缓解。检测肿瘤MDR相关基因编码蛋白可以协助改善化疗用药方案,如MDR1基因和P170为阴性,表明该肿瘤对天然碱类及抗生素类抗癌药物无原发耐药或无明显

15、原发耐药性,因此,在临床上可考虑使用生物碱类、蒽环类、VP-16类抗癌药物。反之,则需调整用药方案。若在化疗过程中,上述标记物出现了阳性反应或过度表达,则说明肿瘤细胞出现了继发性耐药,临床上须调整化疗药物的种类。这对喉癌、喉咽癌患者实施诱导化疗,提高用药有效性,尽可能保留喉功能提供了较为科学的依据。MDR1及P-GP的表达受到癌的发生、发展和分化等因素的调控。Kelley6等分析了未经治疗的头颈部恶性肿瘤53例MDR1阳性表达与肿瘤的生物学特性的关系,发现MDR1表达与肿瘤的分化程度有关,与其他因素如临床分期、淋巴结转移及生存率无关;国内胡同华9用免疫组化法检测了47例未经治疗的头颈部恶性肿瘤

16、的MDR1表达,得出了与Kelley相似的结论。本组发现高分化喉癌、喉咽癌、P-GP含量高于低分化喉癌、喉咽癌者(P0.01),表明高分化肿瘤P-GP的表达能力强,容易发生耐药现象;低分化肿瘤P-GP的表达能力弱,耐药程度相对较低,即P-GP表达与喉癌、喉咽癌组织学分级呈负相关。这与临床化疗结果和文献报道相符。P-GP表达与肿瘤浸润转移有关。吴毅11测定66例分化性甲状腺癌的P-GP含量,发现伴有淋巴结转移者的P-GP表达率为80.6%,而无淋巴结转移者为37.1%,认为P-GP阳性表达的甲状腺癌患者伴有淋巴结转移的可能性较大,应考虑作进一步的治疗或密切随访。蔡晓岚10对25例晚期喉癌、35例

17、喉咽癌患者用RT-PCR法检测多药耐药相关蛋白(MRP)基因,均发现MRP mRNA表达与肿瘤颈淋巴结转移之间有显著的相关性(P0.01),且随颈淋巴结转移分期的增高而明显增高(P=0.01)。我们检测的34例喉癌、喉咽癌患者中,有病理证实的颈淋巴结转移21例(N1期5例,N2期9例,N3期7例),占全部病例的61.7%,其P-GP含量显著高于无淋巴结转移者(P0.01)近年发现,肿瘤复发病例伴有P-GP表达增高。Jain12等发现,复发性口腔鳞癌P-GP表达程度高于原发性口腔性鳞癌和正常对照组。本组病例中2例喉癌手术加放疗后复发、1例喉咽癌放疗后复发,其P-GP含量明显增高(含量范围为13.

18、4±4.6%)。提示喉癌、喉咽癌手术放疗后复发肿瘤可能已获得高度耐药性,故对再次放疗、化疗的效果较差。P-GP含量测定对协助制定喉癌、喉咽癌患者的化疗方案具有指导意义,并为今后喉癌、喉咽癌患者MDR逆转剂及基因治疗的研究提供了依据13。 作者单位：山东侨联医院耳鼻咽喉科,255031李勇山东医科大学附属医院耳鼻咽喉科,250012栾信庸许风雷刘大昱山东医科大学附属医院肿瘤中心,250012张锑参考文献1Chen CJ,Chin JE,Ueda K,et al.Internal duplication and homology with bacterial transport prot

19、eins in the mdrl(P-GP)gene from multidrug resistant human cells.Cell,1996;4:3812Barand MA,Broxterman HJ,Wright KA,et al.Immunodetection of a 190 KD protein in non P-plycoproteincantaining MDR cells derived from small cell and non-small cell lung tumors.Br J Cancer,1992;65:213Michieli M,Damiani D,Erm

20、acora A,et al.P-plycoprotein (P-GP) and lung resistance-related protein(LRP) expression and function in leukaemic blast cell.Br J Haematol,1997;96:3564周江,齐春会,徐元基,等.GST同工酶基因在乳腺癌中的扩增与基因表达.生物化学杂志,1995;11:5515Juliano RL,Limg V,et al.A surface glycoprotein modulating drug permeability in chinese bamster

21、overy cell mutants.Biochem Biophys Acta,1976;445:1526Kelley DJ,Pavelic ZP,Gapany M,et al.Detection of P-plycoprotein in squamous cell carcinomas of the head and neck.Arch Otolaryngol Head Neck Sury,1993;119:4117Pavelic ZP,Reising J,pavelic L,et al.Detection of P-plycoprotein with four monoclonal antibodies in