大血藤黄酮类化合物的提取与分析Ξ

1、武汉植物学研究 2002, 20(2 :157161J ou rna l of W uhan B otan ica l R esea rch大血藤黄酮类化合物的提取与分析 李钧敏 1陈永辉 1金则新 1钟章成 2(1. 台州师范专科学校生化系 , 浙江临海 317000; 2. 西南师范大学生命科学学院 , 重庆北碚 400715关键词 :大血藤叶片 ; 黄酮类化合物 ; 提取 ; 测定 中图分类号 :Q 946文献标识码 :A 文章编号 :10002470X (2002 0220157205Extraction and Ana lysis of Flavono ids from Sa rge

2、n todoxa Cunea ta L I Jun 2M in 1, CH EN Yong 2H u i 1, J I N Ze 2X in 1, ZHON G Zhang 2Cheng 2(1. B iology and Che m istry D ep art m ent , T aiz hou T eachers Colleg e , L inhai , Zhejiang 317000, Ch ina ;2. F acu lty of L if e S ciences , S ou thw est Ch ina N or m al U niversity , Chongqing 4007

3、15, Ch ina Abstract :Several m ethods w ere u sed to ex tract the flavono ids from the leaves of S a rg en tod ox a cunea ta w h ile concen trati on of flavono ids in the ex tracti on w as determ ined by differen t m ethods . T he su itab le quan titative m ethods u sed in the eco logical analysis o

4、f flavon ids w as that u sing u ltra 2 vi o let and 70%ethano lw as the best reagen t fo r ex tracti on . H eating w as no t necessary fo r ex trac 2 ti on . T he con ten t of flavono ids from differen t o rgan s w as leafb lade , annual tw ig , leafstalk and p erenn ial stem in tu rn .Key words :S

5、a rg en tod ox a cunea ta ; F lavono id ; Ex tracti on ; D eterm inati on大血藤 (S a rg en tod ox a cunea ta 隶属大血藤科 大血藤属 , 大血藤科为我国所特有 1。 大血藤为落叶 木质藤本 , 长达 10m , 生于林中 、 灌丛或山沟 , 海拔 为 4001900m , 根和藤可入药 , 有强筋骨 、 活血散 瘀 、 止痛 、 通经之效 , 并可治疗阑尾炎 、 风湿性关节炎 等 , 又可用作杀虫剂 2。 有关大血藤次生代谢产物的 研究国内外较少 :Rm oker 等分离了大血藤的三萜 类皂素

6、如儿茶素等 , 并发现在体内具有明显的抗病 毒效应 3; H an 等证实了大血藤还含有较多的木质 素 , 具有较强的抗氧化及防癌作用 4。 黄酮类化合物 是植物中非常重要的一类次生代谢产物 , 是一类具 有广泛开发前景的天然药物 。 大血藤的茎含有较多 的单宁 , 但大血藤茎及叶的黄酮类化合物的研究至 今未见报道 。 在植物体内 , 黄酮类化合物常与糖结合 形成糖苷 。 黄酮类化合物在植物的分类及系统发育 研究中具有重要的地位 , 研究植物黄酮类化合物的 生态学分布及与环境因子的关系具有重要的意义 。 为了寻找简便可靠的分光光度法用于大血藤黄酮类 化合物的生态学分析 , 我们以分布在天台山华

7、顶森 林公园的大血藤为材料 , 对其叶片黄酮类化合物的 提取方法和测定方法进行了比较与探讨 , 并对不同 器官黄酮类化合物的含量进行了测定 。1材料与方法1. 1材料与仪器样地设在天台山华顶森林公园西茅蓬附近 , 海 拔 820m 。 在样地内选取 5株大血藤植株 , 每株之间 至少间隔 10m , 随机剪取叶片 、 叶柄 、 嫩茎 (一年生 与老茎 (多年生 , 用塑料袋封装 , 立即带回实验室 , 将材料洗净 , 自然风干 , 100水蒸气固定 215m in , 70干燥 12h , 研磨后经过 0125mm 金属网筛 , 将 收稿日期 :2001205216, 修回日期 :200121

8、2216。基金项目 :国家自然科学基金项目资助 (批准号 :39870160 。作者简介 :李钧敏 (1973- , 女 , 硕士 , 从事生物化学与分子生物学的教学与科研工作 。烘干样品放入磨口广口瓶 , 置于 -20冰箱保存 , 备 用 5。紫外分光光度计为日本岛津 U V 27401PC 型 。 1. 2方法1. 2. 1黄酮类化合物的抽提乙 醇 加 热 搅 拌 抽 提 法 6, 7:取 样 品 012g , 置 50mL 小烧杯中 , 加入不同体积比的乙醇 5mL , 在 磁力搅拌器上加热至 60搅拌 30m in , 转换至 10 mL 离心管中 , 4000r m in 离心 5m

9、 in , 取上清至 25 mL 容量瓶中 , 再重复进行搅拌 、 离心 , 上清混合 , 直 至上清无色 , 再用甲醇定容至 25mL , 备用 。乙醇搅拌抽提法 :步骤同上 , 但不进行加热 , 室 温进行搅拌 。1. 2. 2黄酮类化合物含量测定氯化铝显色法 8:取 215mL 抽提样品 , 加入 10mL A lC l 32甲醇溶液 , 充分振摇后 , 测定 A 420。 以 一系列标准浓度的芦丁作标样 , 制定标准曲线 , 得回 归方程为 :y =010386x -010037, r =019998。 硝酸铝显色法 9:取 215mL 样品 , 用 30%乙醇 补充至 1215mL

10、, 加入 0175mL 5%N aNO 2, 加入 0175mL 10%A l (NO 3 3, 室温放置 6m in 后 , 再加 入 5mL 1m o l L N aO H , 混匀 , 30%乙醇稀释至刻 度 , 10m in 后测定 A 510。 以一系列标准浓度的芦丁作 标样 , 制定标准曲线 , 得回归方程为 :y =010167x + 010096, r =019979。直接测定法 6:直接测定样品的 A 360。 以一系列 标准浓度的芦丁作标样 , 制定标准曲线 , 得回归方程 为 :y =0. 0284x -0. 0183, r =0. 9899。紫外测定法 10:取 011

11、mL 样品 , 加入 0. 1% A lC l 32甲醇溶液 112mL , 再加入 117mL 甲醇至 3mL , 充分振摇后 , 测定 A 275。以一系列标准浓度的 芦 丁 作 标 样 , 制 定 标 准 曲 线 , 得 回 归 方 程 为 : y =010455x +010018, r =019999。HPLC 测定法 11:色谱仪为 W aters 2600, 色谱 柱为 C 18柱 (416mm ×250mm , 检测器为 W aters 2 2487D ual A b so rbance D etecto r , 流动相为甲醇 014%磷酸 (45 55v v , 流速

12、为 1mL m in , 柱温 25 , 波 长 360nm , 进 样 量 为 20L , 灵 敏 度 为 015AU FS 。取提取样品真空干燥 , 用色谱甲醇定容 至 25mL , 取 5mL 置 10mL 容量瓶中 , 加入 1mL 25%HC l , 80水 解 1h , 水 解 液 用 甲 醇 定 容 至 10mL , 取 20L 进 行 H PL C 测 定 。 配 制 011m g mL 、 012m g mL 、 013m g mL 、 014m g mL 和 015m g mL 浓度的芦丁甲醇溶液 , 同上水解 , 用 H PL C 法 测 定 , 制 定 标 准 曲 线

13、, 得 回 归 方 程 为 : y =3×108x -312×105, r =019997。2结果与讨论2. 1大血藤叶片黄酮类化合物的提取与测定 植物叶片黄酮类化合物的提取方法较多 , 包括 热水浸泡法 , 乙醇水溶液浸泡法 , 甲醇回流抽提法 等 。 黄酮类化合物易溶于有机溶剂 , 一般采取乙醇水 溶液浸泡法进行叶片黄酮粗制品的提取 。大血藤的茎含有较多的单宁 , 但大血藤茎及叶 的黄酮类化合物的研究至今未见报道 。 在植物体内 , 黄酮类化合物常与糖结合形成糖苷 。 芦丁为槲皮素 232O 2芸香糖苷 , 亦称芸香苷 , 广泛存在于多种植物 体内 , 研究较多 , 因

14、此常作为标准参照物 , 用于植物 粗黄酮含量的测定 。 黄酮类化合物与三氯化铝 、 硝酸 铝等铝盐可形成络合物 , 产生特征性的吸收光谱 , 采 用分光光度法进行粗黄酮含量测定的方法 , 一般有 氯化铝比色法 , 硝酸铝比色法 。 在低浓度的三氯化铝 存在下 , 黄酮类化合物的最大吸收峰可发生位移 , 如 果与标准参照物的吸收峰刚好吻合的话 , 则可用紫 外测定法进行检测 。 另外由于黄酮类化合物的特征 吸收峰 , 因此也可直接在 360nm 测定黄酮类化合 物的含量 。 由于植物叶中黄酮类化合物的种类多 , 总 黄 酮 含 量 测 定 一 直 没 有 统 一 的 标 准 , 九 十 年 代

15、H PL C 测定方法取代了国内曾流行的比色法 , 目前 此法已被许多国家采用 。 本研究将不同抽提方法得 到的大血藤叶片黄酮提取液及标准芦丁用 5种方法 进行测定 , 分析各方法的可行性 , 结果见表 1。 芦丁在 360nm 左右具有较高吸收峰如图 1曲 线 1, 因此可在 360nm 波长处直接测定芦丁的含 量 ; 大血藤叶片黄酮提取液经波长扫描 , 发现在 360nm 处并无吸收峰 , 如图 1曲线 2。芦丁加入 011m o l L A lC l 32甲醇溶液混匀 , 可 在 436nm 处有一明显的吸收峰出现 , 如图 1曲线 3所示 ; 但是大血藤叶片黄酮提取液加入 011m o

16、 l L A lC l 32甲醇溶液混匀 , 经波长扫描 , 在 420nm 处有 一小吸收峰出现 , 如图 1曲线 4所示 。芦丁与 N aNO 2及 A l (NO 3 3反应后 , 再加入 N aO H 可在 510nm 处有一明显的吸收峰 , 如图 1曲 线 5所示 ; 大血藤叶片黄酮提取液在与硝酸铝显色 后经波长扫描 , 在 510nm 处也有一明显的吸收峰 出现 , 如图 1曲线 6所示 , 两者的吻合性较好 。 芦丁处于 0104%A lC l 32甲醇溶液中 , 可出现最表 1大血藤叶片黄酮类化合物的提取方法比较T ab le 1 T he determ inan t of f

17、lavono ids ex tracted from S a rg en tod ox a cunea ta leafb lades w ith differen t m ethods方法M ethods黄酮提取量 (m g g 干重 Ex tracti on rate of flavono ids (m g g -1dry w eigh t 氯化铝显色法硝酸铝显色法直接测定法紫外测定法H PL C 测定法甲醇回流抽提法M ethano l circum fluence27. 80184. 3830. 6341. 2557. 9895%乙醇加热搅拌法95%ethano l heating m

18、ix tu re 23. 28113. 6739. 1255. 7160. 1485%乙醇加热搅拌法85%ethano l heating m ix tu re 25. 02153. 2544. 2970. 8265. 7270%乙醇加热搅拌法70%ethano l heating m ix tu re 20. 42147. 1947. 4171. 4463. 1470%乙醇搅拌法70%ethano l m ix tu re17. 33118. 1447. 7167. 1261. 04高吸收峰的改变 , 如图 1曲线 7所示 , 吸收峰从 260nm 转移至 275nm ; 大血藤叶片黄酮提取

19、液同样 处于 0104%A lC l 32甲醇溶液中 , 经波长扫描 , 发现 其大血藤叶片黄酮提取液的吸收峰从 280nm 转移 至 27415nm , 如图 1曲线 8所示 。 在低浓度的 A lC l 3存在下 , 紫外吸收光谱的改变是所有黄酮化合物的 特征性波谱反应 , 而移动后大血藤黄酮提取液与芦 丁在紫外有吸收峰都出现在 275nm 左右 。大血藤黄酮类化合物水解产物的 H PL C 测定 图谱见图 2。 波长 W avelength (nm 1. 芦丁标样 200600nm 扫描 ; 2. 大血藤叶片 95%乙醇加热搅拌法提取液 200600nm 扫描 ; 3. 芦丁 +011m

20、o l L A lC l 32甲醇溶液 200600nm 扫描 ; 4. 大血藤叶片 95%乙醇加热搅拌法提取液 +011mo l L A lC l 32甲醇溶液 200600nm 扫描 ; 5. 芦丁 +10%A l (NO 3 3400600nm 扫描 ; 6. 大血藤叶片 95%乙醇加热搅拌法提取液 +10%A l (NO 3 3400600nm 扫 描 ; 7. 芦丁 +0104%A lC l 32甲醇溶液 200600nm 扫描 ; 8. 大血藤叶片 95%乙醇加热搅拌法提取液 +0104%A lC l 32甲醇 溶液 200600nm 扫描1. T he w ave scan of

21、 01016m g mL lu tine 2m ethano l from 200to 600nm ; 2. T he w ave scan of flavono ids ex tracted w ith ho t 95%ethano l dilu ted w ith m ethano l from 200to 600nm ; 3. T he w ave scan of lu tine 2m ethano l reacted w ith 011mo l LA lC l 32m ethano l from 200to 600nm ; 4. T he w ave scan of flavono i

22、ds ex tracted w ith ho t 95%ethano l reacted w ith 011mo l L A lC l 32m ethano l from 200to 600nm ; 5. T he w ave scan of lu tine reacted w ith 10%A l (NO 3 3from 400to 600nm ; 6. T he w ave scan of flavono ids ex tracted w ith ho t 95%ethano l reacted w ith 10%A l (NO 3 3from 400to 600nm ; 7. T he

23、w ave scan of lu tine in 0104%A lC l 32m ethano l from 200to 600nm ; 8. T he w ave scan of flavono ids ex tracted w ith ho t 95%ethano l in 0104%A lC l 32m ethano l from 200to 600nm图 1大血藤叶片黄酮含量不同测定方法的波长扫描图谱F ig 11 T he w avelength scan p lo t of flavono ids ex tracted from S a rg en tod ox a cunea t

24、a leafb lades w ith differen t reagen ts 图 2大血藤黄酮水解产物的 HPLC 分析图谱F ig 12 T he H PL C analysis of hydro lyzed flavono ids of S a rg en tod ox a cunea ta 从表 1来看 , 氯化铝显色法测定的值最小 , 并且 由图 1可知此法不适合大血藤叶片粗黄酮含量的测定 。 紫外测定法与 H PL C 测定法测定的值较接近 , 而硝酸铝测定法测定的值则偏高 , 为前两种方法的 2倍左右 。银杏的黄酮类化合物研究较多 , 据文献报道 , 用 硝 酸 铝 测 定 法

25、 测 定 银 杏 叶 片 黄 酮 含 量 大 于 2%12, 13, 如邢世岩等 12报道银杏叶中总黄酮含量 2. 8%; 而采用 H PL C 法进行测定 , 银杏叶中总黄酮含量为 1%左右 14, 15, 如郁青等 14报道浙江 8月份 的银杏叶总黄酮量为 1. 44%。从本文结果及银杏测 定的文献报道结果分析 , H PL C 法与紫外测定法都 适合于大血藤黄酮类化合物含量的测定 。由于进行生态学研究时涉及的样本量较大 , 因 此不适合采用 H PL C 法进行测定 , 而紫外测定法则 比较适合于大血藤粗黄酮含量的生态学分析 。从紫外测定法及 H PL C 测定法测定结果来看 , 不同抽

26、提方法提取的大血藤总黄酮的得率依次为 :70%乙醇加热搅拌法 >85%乙醇加热搅拌法 >70%乙醇搅拌法 >95%乙醇加热搅拌法 , 这与文献 6报 导相符 。 由于加热操作较麻烦 , 且在加热搅拌过程中 乙醇易挥发 , 并且从表 1可知加热与否对大血藤黄 酮得率影响不大 , 因此我们主张在大血藤黄酮提取 过程中宜采用 70%乙醇搅拌法 。 2. 2大血藤不同部位总黄酮的含量测定利用 70%乙醇搅拌法提取大血藤不同器官的 黄酮类化合物 , 盐酸水解后利用 H PL C 法 , 以芦丁水解产物为标样测定黄酮含量 , 结果显示在大血藤叶片中黄酮含量最高 , 达 61104m g

27、g 干重 , 其次是 一年生嫩茎 (21173m g g 干重 、 叶柄 (17197m g g 干重 、 多年生老茎 (14101m g g 干重 。 其中叶片黄 酮含量是一年生嫩茎的 2181倍 、 叶柄的 3140倍 、 多 年生老茎的 4135倍 。 而用紫外吸收法直接测定在大 血藤提取液的黄酮含量 , 可知叶片中黄酮含量最高 , 达 61127m g g 干 重 、 其 次 是 一 年 生 嫩 茎 (21142m g g 干重 、叶柄 (19133m g g 干重 、多年生老茎 (13143m g g 干重 。 其中叶片黄酮含量是一年生嫩 茎的 2186倍 、 叶柄的 3117倍 、

28、 多年生老茎的 4156倍 。2. 3回收率试验另取大血藤叶片样品 011g 进行黄酮类化合物 抽提 , 做 3个平行 。 经 H PL C 测定其含量分别为 80155m g g 干重 、 85142m g g 干重和 84136m g g 干重 , 其变异数为 311%; 经紫外测定其含量分别为 87125m g g 干重 、 81132m g g 干重和 85181m g g 干重 , 在大血藤样品中加入芦丁分别为 015m g 、 1m g 、 2m g , 经 H PL C 测定其含量 , 回收率平均为 9718%; 经 紫 外 测 定 法 测 定 其 回 收 率 平 均 为 961

29、3%, 证明了 H PL C 测定法与紫外测定法测定大 血藤黄酮含量的可行性 。3结语综合文献及笔者的研究结果 , 在生态学研究中 大血藤粗黄酮测定的适用方法是紫外测定法 , 最佳 的提取方法是 70%乙醇提取法 , 加热与否对得率影 响不大 , 但可以节约提取的时间 。 在大血藤植株的不 同器官中 , 粗黄酮含量变化依次是叶片 、 一年生嫩茎 、 叶柄 、 多年生老茎 。参考文献 :1应俊生 , 张玉龙 . 中国种子植物特有属 . 北京 :科学出 版社 , 1994. 536539.2王景祥主编 . 浙江植物志 (第 2卷 . 杭州 :浙江科学 技术出版社 , 1992. 306.3 Rmoker G , M ayer R , Sh in 2K i m J S . T riterpene sapon in s from the Ch inese drug “ D axueteng ” (Cau