第六部分 体外转录及翻译

1、In vitro transcription and In vitro translation目的目的: 体外得到单一体外得到单一,大量的大量的mRNA意义意义: 探针探针-原位杂交原位杂交 siRNA-RNAi Transcript-体外翻译体外翻译,蛋白表达蛋白表达In vitro TranscriptionT7T3EcoRIBamHIAntisense:Cut with EcoRIUse T-3 polymeraseSense:Cut with BamHIUse T-7 polymeraseVector MapsIn vitro TranscriptionPlasmid with T3,

2、 T7 or SP6 promotersLinearization of plasmid DNA by restriction enzymeIn vitro transcription: Plasmid buffer NTP labeled UTP RNA polymeraseDNAse digestion, Phenol/Chloroform extraction and RNA precipitataionGloves should be worn at all times during preparation of in vitro RNA. All solutions should b

3、e RNase-free i.e. made with DEPC water if home-made or bought specifically to use for RNA work. You will need: -Ribonuclease inhibitor (RNasin) -T7 or T3 RNA Polymerase -2.5 mM rNTPs -5 x T7/T3 RNA Polymerase Buffer (200mM Tris.Cl pH 8.0, 125mM NaCl, 40mM MgCl2, 10mM spermidine) -100 mM DTT -RNase-f

4、ree DNase I -DEPC-treated, autoclavedIn vitro transcription reactionLinearize the plasmid at, or near, the terminus of the insert cDNA with a suitable restriction endonuclease. Extract plasmid DNA with an equal volume of phenol/chloroform and an equal volume of chloroform prior to ethanol precipitat

5、ion. Linearized plasmid DNA is resuspended in DEPC-treated, autoclaved TE, pH7.5 at a concentration of approximately 200ng/ul prior to use. In vitro transcription reaction4) The standard reaction conditions are set up containing the following quantities: -2 ul (400 ng) linearized plasmid DNA-20 U ri

6、bonuclease inhibitor-2 ul 100 mM DTT-4 ul 5 x T3/T7 RNA polymerase buffer-4 ul 2.5 mM NTPs-Sterile, DEPC treated H2O to a final volume of 19.5 ul 25 U (0.5 ul) T3/T7 RNA polymerase The reaction mixture is incubated at 37C for 60 minutes. DNA template is removed by the addition of 25U RNase-free DNas

7、e I and a further incubation for 30 minutes at 37C. The reaction mixture is phenol/chloroform extracted twice, ethanol precipitated, vacuum dried and resuspended in 25ul sterile, DEPC-treated TE, pH7.5. RNA can be analysed be electrophoresis using denaturing conditions in an agarose/formaldehyde gel

8、 system. In Vitro Transcription探针探针-原位杂交原位杂交siRNA-RNAiTranscript-体外翻译体外翻译,蛋白表达蛋白表达Advantages of RNA probes:RNA-RNA hybrids are very stableTissue can be digested with RNase (dsRNA is not digested) after the hybridization reducing the backgroundHigher specific activity compared to oligonucleotidesIn V

9、itro Transcribed siRNAs - Equally effective as chemically synthesized siRNAs -Design effective siRNAAdvantages -Price -Shorter turn-around timeDisadvantages -More hands-on -Scalability测序技术测序技术, PCR, RT-PCR技技术术, 芯片技术芯片技术, RNA干扰技术干扰技术核酸信息核酸信息蛋白质功能蛋白质功能DNA水平缺失基因水平缺失基因,上调下调基因的表达水上调下调基因的表达水平对生命过程的影响平对生命过

10、程的影响分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质,研究其基本特性研究其基本特性,直接在直接在蛋白质水平进行研究蛋白质水平进行研究蛋白质功能研究思路蛋白质功能研究思路蛋白样品的获得蛋白样品的获得收集大量的生物材料纯化收集大量的生物材料纯化(材料来源受限材料来源受限)重组表达的方式重组表达的方式(费时费力费时费力)体外表达体外表达 (In vitro translation,快速快速,高通量快速筛选高通量快速筛选)In vitro translation利用体外表达，除了利用载体克隆，更快速的利用体外表达，除了利用载体克隆，更快速的选择是选择是在在PCR时两端加上不同的启动子序时两端加上不同的启动子序列就可以

11、得到体外表达的模板材料了。列就可以得到体外表达的模板材料了。不利用细胞表达不利用细胞表达,体外表达不需要花时间转化转体外表达不需要花时间转化转染细胞、也不需要筛选重组克隆，也不需要培染细胞、也不需要筛选重组克隆，也不需要培养细胞，加入特定的细胞裂解物，利用其中的养细胞，加入特定的细胞裂解物，利用其中的核糖体、合成酶、核糖体、合成酶、tRNA、翻译起始、延伸、终、翻译起始、延伸、终止因子、氨基酸等等蛋白质合成的必需元件，止因子、氨基酸等等蛋白质合成的必需元件，在适合的温度下只需几个小时就可以得到蛋白在适合的温度下只需几个小时就可以得到蛋白质产物，大大节约了时间和精力，在快速鉴别质产物，大大节约了

12、时间和精力，在快速鉴别基因产物上就格外有优势。基因产物上就格外有优势。体外表达可以体外表达可以避免过量表达对细胞的毒性，避免过量表达对细胞的毒性，或或者形成不溶的包含体，者形成不溶的包含体，以及以及表达产物在细胞内表达产物在细胞内的降解，的降解，因而可以表达一些对细胞具有毒性的因而可以表达一些对细胞具有毒性的或者不稳定、容易被降解的蛋白。减少了蛋白或者不稳定、容易被降解的蛋白。减少了蛋白变性复性的困扰。变性复性的困扰。体外表达还可以在体系内添加体外表达还可以在体系内添加特殊的修饰氨基特殊的修饰氨基酸或者标记氨基酸酸或者标记氨基酸，非常灵活，因而在蛋白质，非常灵活，因而在蛋白质折叠和蛋白质功能研

13、究上都有重要应用。折叠和蛋白质功能研究上都有重要应用。Cell-Free Expression Systems: 1: E. coli lysate tolerance 2: Rabbit reticulocyte: better for large proteins 3: Wheat germ extract: better for smaller proteins cheaper than rabbit reticulocyte 真核体外表达体系并非只适用于真核基因，真核体外表达体系并非只适用于真核基因，原核也并非只限于原核表达原核也并非只限于原核表达在灵活的体外表达系统中，只要序列满在灵

14、活的体外表达系统中，只要序列满足启动子和核糖体结合位点的需求，任何系足启动子和核糖体结合位点的需求，任何系统均可匹配任何基因。统均可匹配任何基因。All are prepared as crude extracts containing all the macromolecular components: -70S or 80S ribosomes -tRNAs, aminoacyl-tRNA synthetases -initiation, elongation and termination factors, etc.To ensure efficient translation, eac

15、h extract must be supplemented with: -amino acids -energy sources (ATP, GTP) -energy regenerating systems (creatine phosphate and creatine phosphokinase for eukaryotic systems, and phosphoenol pyruvate and pyruvate kinase for the E. coli lysate) -other co-factors (Mg2+, K+, etc.). 真核真核 VS 原核原核满足启动子和

16、核糖体结满足启动子和核糖体结合位点合位点E. coli lysate对大肠杆菌蛋白合成机制十分了解对大肠杆菌蛋白合成机制十分了解, ,成本低成本低, ,不需加帽不需加帽简单高效简单高效, ,可偶连体外转录和翻译可偶连体外转录和翻译, ,不需分步优化条件不需分步优化条件耐受性耐受性( (在含有其它不同成分杂质时仍可正常工作在含有其它不同成分杂质时仍可正常工作) ) - -加入特殊添加剂加入特殊添加剂( (蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂, ,分子伴侣分子伴侣etc)etc) - -特殊的修饰氨基酸或者标记氨基酸获得带标记蛋白特殊的修饰氨基酸或者标记氨基酸获得带标记蛋白 弹性大弹性大, ,加入优化成份一提

17、高产率和溶解性加入优化成份一提高产率和溶解性( (例如：修例如：修饰过的反应环境可以变成氧化环境以帮助蛋白形成正饰过的反应环境可以变成氧化环境以帮助蛋白形成正确的二硫键，然后正确的折叠。确的二硫键，然后正确的折叠。) ) E.coli T7 S30S30S30原核体外翻译系统的原核体外翻译系统的E.coli T7 S30E.coli T7 S30提取物提取物是由是由OmpTOmpT内切蛋白酶和内切蛋白酶和LonLon蛋白酶缺陷的蛋白酶缺陷的E.coli BE.coli B菌株制备菌株制备, ,因此可增加稳定性因此可增加稳定性, ,尤其适尤其适用于在体外表达时易被蛋白酶降解的蛋白质用于在体外表达

18、时易被蛋白酶降解的蛋白质. .也适合那些在体内表达由于宿主编码的抑制酶也适合那些在体内表达由于宿主编码的抑制酶作用而表达水平低的蛋白质作用而表达水平低的蛋白质, ,使其能高表达使其能高表达. .还可用于转录和翻译调控的研究还可用于转录和翻译调控的研究可合成少量标记蛋白质用于蛋白纯化中作为示可合成少量标记蛋白质用于蛋白纯化中作为示踪物质以及在蛋白质中掺入非天然的氨基酸用踪物质以及在蛋白质中掺入非天然的氨基酸用于研究蛋白质的结构功能于研究蛋白质的结构功能S30体外翻译系统体外翻译系统 (Promega)灵活灵活, ,能使用含有能使用含有T7T7启动子和一个核糖体结合位启动子和一个核糖体结合位点的任

19、何克隆进行翻译点的任何克隆进行翻译稳定稳定, ,减少所表达蛋白质被降解的机会减少所表达蛋白质被降解的机会简便简便, ,包含和所有偶联的转录包含和所有偶联的转录/ /翻译所需要的组份翻译所需要的组份低背景低背景, ,系统合成的内源蛋白质水平低系统合成的内源蛋白质水平低缺少一种氨基酸的氨基酸混合物以备标记需要缺少一种氨基酸的氨基酸混合物以备标记需要使用方便使用方便-混合好需要的各组分和模板混合好需要的各组分和模板,37,37度度保温保温1-21-2小时后置冰上小时后置冰上5 5分钟分钟PAGEPAGE电泳电泳,western,western检测检测, ,或或TCATCA沉淀纯化沉淀纯化S30的应用

20、的应用合成放射性同位素标记的蛋白质合成放射性同位素标记的蛋白质在在E.coliE.coli体内表达蛋白质之前核实克隆的基因体内表达蛋白质之前核实克隆的基因用蛋白质进行转录和翻译调控的研究用蛋白质进行转录和翻译调控的研究用蛋白质作为蛋白纯化的示踪物用蛋白质作为蛋白纯化的示踪物在蛋白质中掺入非天然氨基酸作结构研究在蛋白质中掺入非天然氨基酸作结构研究Roche RTS E.Coli偶联反应:连续交换无细胞连续交换无细胞(CECF)系统反应系统反应高产率高产率(HY)(HY)生化体系生化体系Roche RTS E.ColiRabbit reticulocyte(兔网织红细胞系统兔网织红细胞系统)兔网织

21、红细胞用活大白兔制备兔网织红细胞用活大白兔制备, ,通过纯化除去兔通过纯化除去兔网织红细胞以外的污染细胞网织红细胞以外的污染细胞. .兔网织红细胞裂解后兔网织红细胞裂解后, ,提取物用微球菌核酸酶破提取物用微球菌核酸酶破坏内源坏内源mRNA,mRNA,最大限度降低翻译背景最大限度降低翻译背景裂解物包含了蛋白质合成所必需的细胞内组分裂解物包含了蛋白质合成所必需的细胞内组分(tRNA,(tRNA,核糖体核糖体, ,氨基酸氨基酸, ,起始起始, ,延伸延伸, ,终止因子终止因子) )添加了磷酸肌酸和磷酸肌酸激酶的能量生成系添加了磷酸肌酸和磷酸肌酸激酶的能量生成系统统, ,以及氯化高铁血红素防止翻译起

22、始的抑制以及氯化高铁血红素防止翻译起始的抑制添加了添加了tRNAstRNAs混合物用于扩大混合物用于扩大mRNAmRNA翻译范围翻译范围网织红细胞无细胞核网织红细胞无细胞核, ,保留高效翻译各种核酸信息保留高效翻译各种核酸信息的能力的能力由红细胞分化而来由红细胞分化而来, ,在体内主要负责合成大量血红在体内主要负责合成大量血红蛋白以及球蛋白蛋白以及球蛋白(90%(90%以上以上).).内源的核酸酶很少内源的核酸酶很少, ,有助于长链有助于长链RNARNA的稳定的稳定, ,可以合可以合成较大的蛋白成较大的蛋白有内源球蛋白有内源球蛋白mRNA,mRNA,可通过钙离子依赖的核酸酶除可通过钙离子依赖的

23、核酸酶除去去, ,并通过并通过EDTAEDTA处理使核酸酶失活处理使核酸酶失活Wheat germ extract(麦胚提取物系统麦胚提取物系统)cheaper than rabbit reticulocyte麦胚芽提取物经在提取物缓冲液中碾碎麦胚芽，再麦胚芽提取物经在提取物缓冲液中碾碎麦胚芽，再经离心除去细胞碎片制得。上清夜经过了层析，将经离心除去细胞碎片制得。上清夜经过了层析，将抑制翻译的内源氨基酸和植物色素从提取物分开。抑制翻译的内源氨基酸和植物色素从提取物分开。提取物用微球菌核酸酶处理过，破坏了内源提取物用微球菌核酸酶处理过，破坏了内源mRNA，以把背景翻译减到最小。麦胚芽提取物包含蛋

24、白合以把背景翻译减到最小。麦胚芽提取物包含蛋白合成所必需的细胞组分（成所必需的细胞组分（tRNA，核糖体，起始、延，核糖体，起始、延伸和终止因子）伸和终止因子）.使用前透析使用前透析,提取物中添了磷酸肌酸和磷酸肌酸激提取物中添了磷酸肌酸和磷酸肌酸激酶的能量生成系统酶的能量生成系统,以及增加链延伸效率的亚精胺以及增加链延伸效率的亚精胺,以及一定量的乙酸镁氯化高铁血红素防止翻译起始以及一定量的乙酸镁氯化高铁血红素防止翻译起始的抑制的抑制由于内源的由于内源的mRNA很少，这个系统可用于各种病毒、很少，这个系统可用于各种病毒、酵母、高等植物乃至哺乳动物蛋白的合成。酵母、高等植物乃至哺乳动物蛋白的合成。

25、 当表达产物较难与球蛋白区分（当表达产物较难与球蛋白区分（1215kD）、或者）、或者表达产物正好可能是哺乳动物细胞中富含而植物中表达产物正好可能是哺乳动物细胞中富含而植物中没有的调控因子一类的蛋白时、或者是不明原因表没有的调控因子一类的蛋白时、或者是不明原因表达不出时，就不妨尝试麦芽提取物体系。达不出时，就不妨尝试麦芽提取物体系。可稳定表达一些在兔网织红细胞系统中翻译受到抑可稳定表达一些在兔网织红细胞系统中翻译受到抑制的制的DNA,如那些含有低浓度的双链如那些含有低浓度的双链mRNA的模板的模板要求要求RNA有帽子结构才能更好的翻译有帽子结构才能更好的翻译在合成分子量较大的蛋白质时常提前终止

26、在合成分子量较大的蛋白质时常提前终止 Two approaches to in vitro protein synthesis based on the starting genetic material: RNA or DNA.Standard translation systems, such as reticulocyte lysates and wheat germ extracts, use RNA as a template. Because the transcription and translation reactions are separate, each can be

27、optimized to ensure that both are functioning at their full potential. Whereas coupled“ systems start with DNA templates, which are transcribed into RNA then translated. Schematic of In-vitro TranslationRNA generated in vitro utilizes T7, SP6 or T3 RNA polymerase in a separate uncoupled reactionIn V

28、itro Transcription and Translation Procedure Using Rabbit Reticulocyte Lysate. Coupled Transcription:TranslationUnlike eukaryotic systems where transcription and translation occur sequentially, in E. coli, transcription and translation occur simultaneously within the cell. In vitro E. coli translati

29、on systems are thus performed the same way, coupled, in the same tube under the same reaction conditions. During transcription, the 5 end of the RNA becomes available for ribosomal binding and undergoes translation while its 3 end is still being transcribed. This early binding of ribosomes to the RN

30、A maintains transcript stability and promotes efficient translation. This bacterial translation system gives efficient expression of either prokaryotic or eukaryotic gene products in a short amount of time. For the highest protein yield and the best initiation fidelity, make sure the DNA template ha

31、s a Shine-Dalgarno ribosome binding site upstream of the initiator codon. Capping of eukaryotic RNA is not required. Use of E.coli extract also eliminates cross-reactivity or other problems associated with endogenous proteins in eukaryotic lysates. Also, the E. coli S30 extract system allows express

32、ion from DNA vectors containing natural E. coli promoter sequences (such as lac or tac). Coupled in Vitro Transcription:Translation Procedure Using E. coli Extract. mRNA设计要求设计要求 用原核和真核细胞的用原核和真核细胞的mRNA转录本有明显的区别。通常真核转录本有明显的区别。通常真核mRNA带有转录后加工的带有转录后加工的5-7 methyl-GTP cap 和和3poly(A)tail，有助于增加有助于增加mRNA的稳定性

33、，防止降解。同时的稳定性，防止降解。同时5帽子结构有助于帽子结构有助于核糖体与核糖体与mRNA的结合和的结合和AUG起始密码的正确识别。对应不同的起始密码的正确识别。对应不同的体外表达系统，在设计体外表达系统，在设计RNA模版的时候就要区别对待。模版的时候就要区别对待。 原核生物中，核糖体受一段富含嘌呤的原核生物中，核糖体受一段富含嘌呤的SD序列引导从而识别序列引导从而识别AUG起始密码。这段位于起始密码。这段位于AUG上游的序列和上游的序列和30S核糖体亚基的核糖体亚基的16s rRNA一段序列互补，保守区一段序列互补，保守区5-UAAGGAGGUGA-3，核糖体结，核糖体结合位点合位点RB

34、S和起始密码和起始密码AUG之间的距离以及碱基的组成对翻译的之间的距离以及碱基的组成对翻译的效率有显著影响。效率有显著影响。 而真核生物的那段保守序列成为而真核生物的那段保守序列成为Kozak序列（序列（5-GCCACCAUGG-3），要高效翻译，），要高效翻译，+1G和和-3A就很重要。不过就很重要。不过如果如果mRNA没有这段没有这段Kozak序列而有一段适当长度序列而有一段适当长度5UTR也能够也能够有效地在无细胞体系中得到翻译。有效地在无细胞体系中得到翻译。 有数据提示，大肠杆菌的核糖体通常只认得有数据提示，大肠杆菌的核糖体通常只认得SD序列，而真核序列，而真核比如网织红细胞的核糖体能

35、识别比如网织红细胞的核糖体能识别Kozak序列，也能识别序列，也能识别SD序列。序列。The +1 is the first base of the AUG initiator codon (shaded) responsible for binding of fMet-tRNAfMet. The underlineindicates the ribosomal binding site sequence, which is requiredfor efficient translation.体外翻译的应用体外翻译的应用Northern BlotRT-PCR实时荧光定量实时荧光定量PCR（re

36、al-time quantitative PCR） 绝对定量（用已知的标准曲线来推算未知的样本的量）绝对定量（用已知的标准曲线来推算未知的样本的量） 绝对定量首先必须构建与检测样品目的基因具有相同绝对定量首先必须构建与检测样品目的基因具有相同序列的标准品。使用已知浓度的标准品制作序列的标准品。使用已知浓度的标准品制作5个点以上个点以上的标准曲线后，可以使用标准曲线对未知浓度的检测的标准曲线后，可以使用标准曲线对未知浓度的检测样品进行绝对量（起始拷贝数）分析。样品进行绝对量（起始拷贝数）分析。相对定量（在一定样本中靶序列相对于另一参照样本相对定量（在一定样本中靶序列相对于另一参照样本的量的变化）

37、的量的变化） 基因表达的研究一般采用相对定量的方法。相对定量基因表达的研究一般采用相对定量的方法。相对定量法必须对样品的目的基因和参比基因内标同时分别进法必须对样品的目的基因和参比基因内标同时分别进行定量，然后求出对于参比基因的目的基因的相对量。行定量，然后求出对于参比基因的目的基因的相对量。通过对样品间的目的基因的相对量进行比较，可以对通过对样品间的目的基因的相对量进行比较，可以对不同样品间的不同样品间的mRNA进行表达量分析。参比基因通常进行表达量分析。参比基因通常选用表达量相对恒定的选用表达量相对恒定的House Keeping Gene， 如：如：GAPDH、b-actin等。通过同时

38、对参比基因的实时检测，等。通过同时对参比基因的实时检测，可以对样品之间由于起始细胞数不同、或可以对样品之间由于起始细胞数不同、或RNA提取效提取效率的不同等造成的率的不同等造成的RNA量误差进行校正，达到在严格量误差进行校正，达到在严格意义上对样品之间的意义上对样品之间的mRNA表达量进行分析之目的。表达量进行分析之目的。Northern Blot (绝对定量绝对定量)体外转录合成体外转录合成mRNA, 取取0, 20, 50, 100, 200, 500 pg 不同浓度不同浓度mRNA电泳电泳,Northern blot根据放射性强度做标准曲线根据放射性强度做标准曲线样品样品RNA(总总RN

39、A 20ug或或mRNA1-5ug),电泳电泳,Northern blot检测放射性强度，根据标准曲线定量检测放射性强度，根据标准曲线定量Northern Blot (相对定量相对定量)mRNA isolation and purificationelectrophorese on a gelThe gel is probed by hybridizing with a labeled clone for the gene under study.RT-PCRIsolate and purify mRNAreverse transcriptionPCR amplificationrun on gel 实时荧光定量实时荧光定量 PCR PCR 的化学原理包括探针类和的化学原理包括探针类和非探针类两种非探针类两种: :-探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加扩增产物的增加-非探针类则是利用荧光染料或者特殊设计的引非探针类则是利用荧光染料或者特殊设计的引物来指示扩增的增加物来指示扩增的增加 前者由于增加了探针的识别步骤，