山茱萸生品及制品二氯甲烷萃取部位对D-半乳糖致衰小鼠骨髓细胞的影响

1、山茱萸生品及制品二氯甲烷萃取部位对D-半乳糖致衰小鼠骨髓细胞的影响         11-04-30 10:09:00     编辑：studa20                     作者：赵青春,董菊,杨柳,王明艳,杜逸芳【摘要】  目的 研究山茱萸生

2、、制品二氯甲烷萃取部位对D-半乳糖致衰小鼠骨髓细胞的影响。方法 单细胞电泳观察D-半乳糖致衰小鼠骨髓细胞DNA损伤情况,RT-PCR法检测小鼠骨髓细胞p53基因的表达情况。结果 D-半乳糖致衰模型组小鼠骨髓细胞DNA拖尾率高于正常对照组(P0.05),且、级(中重度)损伤细胞数较多；山茱萸生品及制品二氯甲烷萃取部位组小鼠骨髓细胞DNA的拖尾率均低于D-半乳糖致衰模型组(P0.05)。D-半乳糖致衰模型组小鼠骨髓细胞p53基因的表达高于正常对照组、阳性药组及制品组。结论 D-半乳糖致衰小鼠骨髓细胞DNA有损伤,山茱萸生、制品二氯甲烷萃取部位对D-半乳糖致衰小鼠骨髓细胞有保护作用；D-半乳糖致衰小

3、鼠骨髓p53基因表达上调,山茱萸制品二氯甲烷萃取部位能显著下调D-半乳糖致衰小鼠骨髓p53基因的表达。 【关键词】  山茱萸；二氯甲烷萃取部位；D-半乳糖；骨髓细胞；小鼠    Abstract：Objective To study the influences of dichloromethane extraction from crude and processed Cornus Officinalis on bone marrow cells of aging mice induced by D-galactose. Methods DNA dam

4、age of bone marrow cells of aging mice induced by D-galactose was detected by the comet assay, the expression of p53 mRNA was detected by RT-PCR. Results The tail formation rate of model group was significantly higher than the rate of control group (P0.05) with a large number of and DNA damage cells

5、. The tail formation rate of dichloromethane extraction groups were both significantly lower than the rate of model group (P0.05). p53 mRNA expression of model group was higher than the rest except the crude Cornus Officinalis group. Conclusion There is DNA damage of bone marrow cells of aging mice

6、induced by D-galactose. Both dichloromethane extraction from crude and processed Cornus Officinalis are protective. p53 mRNA expression up-regulates in model group, while its significantly down-regulation is detected in the processed Cornus Officinalis group.    Key words：Cornus Offic

7、inalis；dichloromethane extraction；D-galactose；bone marrow cells；mice 山茱萸为山茱萸科落叶小乔木植物山茱萸(Cornus officinalis Sieb.et Zucc.)的干燥成熟果肉,又名枣皮、山芋、药枣、肉枣(本草纲目)、实枣儿(救荒本草)等1-2,其味酸、涩,微温,归肝、肾经,功能补益肝肾、涩精固脱。临床用于内热消渴、眩晕耳鸣、腰膝酸痛、阳痿遗精、尿遗尿频、崩漏带下、大汗虚脱等。近年研究表明,山茱萸具有调节免疫、降血糖、抗休克、抑制血小板聚集、抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌、保肝、治疗不育症等多种药理作用3。本实

8、验在以往课题研究的基础上,选取山茱萸生、制品二氯甲烷萃取部位,研究其对D-半乳糖致衰小鼠骨髓细胞的影响。1  实验材料1.1  药物与试剂    吐温-80、D-半乳糖,国药集团化学试剂有限公司,批号F20080324；生理盐水,上海百特医疗用品有限公司；维生素E胶丸,浙江医药股份有限公司新昌制药厂；TRIZOL,invitrogen；RT-PCR试剂盒,Promega；琼脂糖,中国医药上海化学试剂公司；TBE,生工·生物工程(上海)有限公司；正常熔点琼脂糖(NMPA),华美生物工程公司产品；低熔点琼脂糖(LMPA),Sigma公司产

9、品,进口分装；TritonX-100,Amresco公司产品,进口分装；溴化乙锭(EB),Sigma公司产品,进口分装。1.2  动物    ICR级小鼠,(20±2)g,上海斯莱克实验动物有限责任公司提供,生产许可证：SCXK(沪)2007-0005。2  实验方法2.1  供试药的制备    山茱萸生品购自河南省西峡县,经南京中医药大学陈建伟教授鉴定为山茱萸Cornus officinalis Sied.et Zucc.的干燥成熟果肉,其炮制品由南京中药饮片厂依据中华人民共和国药典(一部)2

10、005年版方法炮制,即取净山茱萸肉,加酒拌匀,置容器内加热蒸至酒吸尽,取出,干燥。山茱萸总提二氯甲烷部位的制备：取山茱萸生品、制品各500 g,用10倍量95%乙醇回流提取1.5 h,抽滤,药渣加10倍量50%乙醇回流提取1.5 h,抽滤,药渣加10倍量蒸馏水回流提取1.5 h,抽滤,合并滤液,60 旋转蒸发浓缩至1 000 mL。用二氯甲烷(11)萃取,直至下层近无色(5次),合并二氯甲烷萃取液,浓缩至干,得到总提二氯甲烷生制品部位。用植物油、吐温-80、蒸馏水按118比例配成200 mL的乳剂(0.5 g/mL)4。本实验选用剂量根据前期实验摸索,选用临床等效量的高剂量4。2.2 

11、; D-半乳糖溶液的制备    取D-半乳糖5 g溶于100 mL生理盐水中,制成5%D-半乳糖溶液。2.3  阳性药的制备    阳性药选取维生素E,用植物油、吐温-80、蒸馏水按118比例配成200 mL的乳剂(400 mg/100 mL)。2.4  分组与给药    取ICR级小鼠50只,随机分为5组,每组10只,雌雄各半。分为模型组(生理盐水)、生品组(生品二氯甲烷萃取部位)、制品组(制品二氯甲烷萃取部位)、阳性药组(维生素E)、正常组(生理盐水)。各组每日按0.2 mL/10

12、 g剂量灌胃给药1次,模型组和给药组皮下注射5%D-半乳糖溶液1次,连续30 d5。2.5  动物取材    给药结束后取血,并从取血后的小鼠股骨处取出骨髓,备用。2.6  单细胞电泳NMPA 50 L铺第1层胶,压片；制备好的细胞混悬液5 L与45 L LMPA铺作第2层胶,压片；50 L LMPA铺第3层胶,压片；揭去盖玻片,倒入新鲜配制预冷的细胞裂解液,置4 冰箱,避光裂解1 h。把预冷的DNA解旋液倾入电泳槽中,避光解旋20 min。调节电压为25 V(定压),电流160 mA,电泳20 min。凝胶片用中和液中和漂洗3次,每次1 min。EB染色。24 h内在荧光显微镜下用515560 nm的激发光观察并测量彗星尾长。把细胞损伤分为不同的等级,正常：20 m；级损伤：2040 m；级损伤：4060 m；级损伤：6080 m；级损伤：80 m。结果采用SPSS15.0统计软件进行数据分析。2.7  骨髓总RNA的提取  收获骨髓细胞,生理盐水冲3次, 1 000 r/min离心10 min,取沉淀,移入1.5 mL Eppendorf管中,加入1 mL TRIZOL试剂,用加样器吹至液体澄清且无组织团块,