类天疱疮的临床特征与其靶抗原关系的研究

1、类天疱疮的临床特征与其靶抗原关系的研究*         06-07-01 10:19:00     编辑：studa20   作者：金 岩1，黄 懿1，成 扬2，付海军3【摘要】  对56例江浙沪地区类天疱疮患者的临床特征和不同靶抗原的关系进行了探讨，发现类天疱疮多发于老年人，并以大疱性多见；在BP的急性期抗体结合230kD、230/180kD、合并条带靶抗原较常出现(86.11%)；而在疾病的缓解期抗体结合180kD抗原较常出现(65%)；1

2、80kD靶抗原并非次要抗原。        【关键词】  类天疱疮；临床特征；靶抗原        【Abstract】  56 cases of bullous pemphigoid(BP) were studied on the clinical characters and immunol-blot patterns.It was found that bullous pemphigoid happened mostly among old

3、 people in bullous type；Autoantigen BP230，BP230/180 and BP 230/180 combined with minor antigens involved in acute phase of BP patient；While BP180 involved mainly in the remission of the disease.Autoantigen BP180 were not minor antigen.        【Key words】  bullous p

4、emphigoid；clinical characters；autoantigen        大疱性类天疱疮(BP)是一种发生于老年人的自身免疫性大疱病，临床表现为全身泛发性、张力性大疱，尼氏征阴性，病程反复迁延，严重威胁患者的生命健康。BP血清中有多种抗皮肤基底膜不同成分的抗体，有靶抗原分子量为230kD、200kD、180kD、140kD、100kD等，为了进一步探讨BP的临床特征和其靶抗原的关系，我们拟对临床收集的56例病例及其免疫印迹的结果综合分析。       

5、 1  材料与方法        1.1  临床资料        1.1.1  研究对象  选择1999年12月2001年12月华山医院皮肤科和东方医院门诊、病房就诊的江、浙、沪地区汉族类天疱疮患者，根据临床表现、组织病理和直接免疫荧光检查，符合诊断标准确诊。        1.1.2  方法  我科专病门诊、病房大疱病患者，常规做病理活检，手术时将切下的

6、组织块分为两份，一份做常规组织病理检查，另一份做直接免疫荧光检查；确诊的BP患者抽取外周新鲜血5ml，留血清-20冻存用于测定BP抗原分子量；除对患者的一般情况如年龄、性别、发病时间等进行记录外，并根据以下内容对BP病例进行登记、随访。(1)临床类型：根据临术表现将BP分为大疱性、小疱性、局限性和痒疹性等。(2)黏膜损害情况：有黏膜损害；无黏膜损害。(3)痒感：有明显痒感；无明显痒感。(4)病情：重度：指不断出现张力性水疱和显著红斑，累及体表面积50%以上；中度：指皮损面积在20%50%之间；轻度：皮疹散在分布或局限在身体某一部位，皮疹面积在20%以下。(5)病期：活动期：指患者不断出现张力性

7、水疱和显著红斑；稳定期：无明显水疱发生，只有陈旧皮损。        1.2  皮肤表皮抗原的提取        1.2.1  材料        1.2.1.1  组织  取新鲜外科截肢手术皮肤6cm×6cm数块。        1.2.1.2  主要试剂及仪器  三羟甲基氨基甲烷(TR

8、IS，FARCO产品)；苯甲基磺酰氟(PMSF，Promega产品)；依地酸钠(EDTA，Sigma产品)；蛋白酶抑制剂(pepstatin，antipain，leupeptin，chymostotin，Sigma公司产品)；十二烷基硫酸钠(SDS，日本进口分装)；高速低温离心机(HITACHI，日本进口)；751型分光光度计(上海第三分析仪器厂)；热分离缓冲液；12.5mmol TRIS-HCl，pH6.8，100l PMSF(热分离前加)；表皮提取液：2%SDS，65mmol TRIS-HCl，pH6.8，20mmol PMSF，10mmol EDTA，含四种蛋白酶抑制剂(热分离前加)。&

9、#160;       1.2.2  方法  (1)新鲜外科手术皮肤标本，用图钉固定在木板上，用手术刀除皮下脂肪组织，削真皮至0.5mm厚，冷生理盐水反复冲洗。(2)热分离缓冲液分两份，一份置37水浴，另一份置56水浴，10min备用。(3)将皮肤剪成2cm×2cm大小，放入37热分离缓冲液20min，再迅速放入56热分离缓冲液中40s，取出冷却，用手术刀背轻轻分离表真皮。(4)表皮按2530cm2比1ml的比例加入表皮提取液中，放入组织匀浆器内匀浆(匀浆器放冰中)。(5)匀浆液置塑料管中，于液氮中反复冻融3次，每

10、次10min，后12000rpm离心，4，30min，取上清即为表皮提取液，-40保存。 (6)751分光光度计测定表皮抗原提取液蛋白含量，在595nm处测OD值，参照标准蛋白(小牛血清白蛋白)，计算样品中蛋白含量。        1.3  SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳        1.3.1  材料  (1)表皮抗原提取液；(2)主要试剂及仪器丙烯酰胺(acrylamide，Fluka产品)；甲叉丙烯酰胺(N，N-Methylenebis-ac

11、rylamide，Fluka产品)；四甲基已二胺(TEMED，Promega产品)；过硫酸胺(APS，华美公司产品)；次高分子量标准分子蛋白(上海生化所产品)；甘氨酸(Gly，上海试剂三厂，分析纯)；三羟甲基氨基甲烷(TRIS，FARCO产品)；2-巯基乙醇(2-ME，Fluka产品)；垂直电泳槽(上海精益有机玻璃制品厂)；稳流稳压电泳仪(丹阳无线电一厂)；聚丙烯酰胺母液(Acr-Bis，丙烯酰胺30g，甲叉丙烯酰胺0.8g，双蒸水加至100ml，磁力搅拌溶解，过滤，置棕色瓶4保存)；浓缩胶(Acr-bis 0.6ml，0.5M pH6.8 1.25ml，双蒸水3.1ml，10%SDS 0.0

12、5ml，10%APS 0.025ml，TEMED 5l)；分离胶(Acr-Bis 2.3ml，1.5M pH8.8 Tris-HCl 2.5ml，双蒸水5ml，10%SDS 0.1ml，10%APS 0.1ml，TEMED 10l)；电泳缓冲浓缩液(Tris 15g，Gly 7.2g，SDS 5g，双蒸水加至500ml，过滤，使用时110稀释)；样品液(12mM Tris-HCI pH6.8，含20%甘油，10%SDS，10%2-ME，溴酚蓝适量)。表皮提取液与样品液11混合，用时煮沸；固定液(500ml无水乙醇，100ml冰醋酸，400ml双蒸水)；脱色液(250ml无水乙醇，80ml冰醋酸

13、，加双蒸水至1000ml)；染色液(考马斯亮兰0.29g，加250ml脱色液，棕色瓶4保存)。        1.3.2  方法        1.3.2.1  SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳  将干净的长短玻璃板用橡皮圈套好，放入垂直电泳槽，螺母固定，底边缝隙用1%琼脂封闭，配制分离胶，轻倒入两玻璃板间空隙内，再加入少量含正丁醇双蒸水，将分离胶压平，静置，过夜，倒去水，配制浓缩胶，轻倒入分离胶上方空隙内，插入塑料梳，静置3h。轻取塑料梳，分别加入标

14、准品和样品，两侧水槽内加入电泳缓冲液，100V，1h，再160V 34h。        1.3.2.2  显色  将电泳好的凝胶小心取出，放入固定液中，置摇床上摇动1h；再将凝胶放入染色液中，56，摇动10min；再放入脱色液中，摇动过夜。最后观察凝胶上抗原蛋白的分离效果确定是否转印。        1.3.2.3  蛋白质抗原分子量的测定  在一定的分子量范围内，蛋白质的泳动率和分子量的对数呈直线关系。logMWK1-bxb：斜率；

15、x：泳动率    在实际测定时，可先测量标准蛋白质自分离胶起点至区带中线距离做横轴坐标，然后将标准蛋白质分子量换算成对数值作纵坐标，作出标准曲线。测量蛋白抗原的电泳距离，在曲线上查出相应的分子量的对数值，即可计算出待测蛋白质的分子量。        1.4  Western-blot        1.4.1  材料        1.4.1.1  材料&#

16、160; 经上述SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳好的凝胶。        1.4.1.2  试剂和仪器  甘氨酸(Gly，上海试剂三厂)；小牛血清白蛋白(BSA，中科院生化所产品)；辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG抗体(Sigma产品)；半干式转印电泳槽(上海医科大学仪器中心产品)；硝酸纤维膜(NC，浙江黄岩生化材料厂)；印度墨水染色液(12.5mM Tris-HCI，pH 6.8，1%印度墨水)；转移电泳缓冲液(Tris 3g，Gly 14.4g，SDS 1g，ddH2O 600ml，临用前加入甲醇150ml)。        1.4.2  方法        1.4.2.1  蛋白转移电泳  将电泳好的凝胶去除浓缩胶和琼脂糖，置于转移电泳液中20min，裁取与凝胶相同大小的NC膜和6张滤纸，另置于转移电泳液中15min，将3张湿滤纸、NC膜、凝胶、3张湿滤纸依次叠压在一起，放入半干式转印电泳槽中，再加入适量转移电泳液，50V，电泳1h左右，将NC膜取出，用印度墨水染液染色，观察转移效果和标准蛋白位置。