课题2__多聚酶链式反应扩增DNA片段

1、DNA的立体结构的立体结构 双螺旋结构双螺旋结构多聚酶链式反应多聚酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR技术技术)一种在体外快速扩增一种在体外快速扩增DNA的方法，故又的方法，故又称为称为DNA体外扩增技术体外扩增技术。脱氧脱氧核糖核糖含氮碱基含氮碱基磷酸磷酸A G C T12345OATGCAGCT5端端3端端5端端3端端1 1、 条件：条件： 模板：模板： 亲代亲代DNADNA的两条母链的两条母链 原料：原料： 游离的四种脱氧核苷酸游离的四种脱氧核苷酸 能量：能量： ATPATP 酶：酶： 解旋酶解旋酶 、DNADNA聚合酶聚合酶 引物：能与引物：能与DNA

2、DNA母链的一段碱基序列互母链的一段碱基序列互补配对补配对（二）细胞内（二）细胞内DNADNA复制的过程复制的过程3、DNA复制的方向DNA的合成方向总是从子链的的合成方向总是从子链的5端向端向3端延伸端延伸2 2、过程、过程条件条件组分组分作用作用模板模板DNADNA的两条单链的两条单链提供复制的模板提供复制的模板原料原料四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸合成合成DNADNA子链的原料子链的原料酶酶解旋酶解旋酶TaqDNA聚合酶聚合酶不需要不需要催化合成催化合成DNADNA子链子链能量能量ATPATP不需要不需要引物引物一般是一小段一般是一小段DNADNA使使DNADNA聚合酶能够从引物的聚合酶能

3、够从引物的3 3端开始连接脱氧核苷酸端开始连接脱氧核苷酸 1 1、PCRPCR的技术（的技术（DNADNA体外复制）的条件体外复制）的条件DNADNA双链双链单链单链变性（加热变性（加热80-10080-100 ）复性（缓慢冷却）复性（缓慢冷却）二、二、PCRPCR技术原理技术原理1234522557294时间（时间（minmin）温度（）适温延伸高温变性低温复性重复13步30轮3、DNA复制的方向DNA的合成方向总是从子链的的合成方向总是从子链的5端向端向3端延伸端延伸2 2、步骤：、步骤：变性变性 复性复性延伸延伸PCR循环循环-变性变性9595变性变性PCR循环循环-变性变性9595变性

4、变性PCR循环循环-变性变性9595变性变性PCR循环循环复性复性5555复性复性PCR循环循环延伸延伸PCR循环循环延伸延伸PCR循环循环延伸延伸PCR循环循环延伸延伸二、二、PCR的反应过程的反应过程 5/3/3/5/5/3/引物引物5/3/引物引物变性变性95oC复性复性55oC延伸延伸72oC5/3/3/5/5 引物引物15 引物引物2第二次复制第二次复制第一次复制第一次复制5 5 5 5 5 5 模板模板DNA5 5 5 5 5 5 5 5 每个循环包括：每个循环包括：变性变性 复性复性延伸延伸从第二轮循环开始，上一次循环的产物也从第二轮循环开始，上一次循环的产物也可以作为模板参与反

5、应可以作为模板参与反应DNADNA聚合酶只能特异性地复制聚合酶只能特异性地复制处于两个引物处于两个引物之间的之间的DNADNA序列，序列，使这段固定长度的序列使这段固定长度的序列呈呈指数扩增。指数扩增。PCRPCR的反应过程总结：的反应过程总结：三、三、 PCR反应的实验操作反应的实验操作实验步骤：实验步骤：准备准备好好PCRPCR反应体系的配方反应体系的配方用微量用微量移液器移液器按配方在往微量按配方在往微量离心管中加入各组分离心管中加入各组分盖严盖子，用手指轻轻弹击盖严盖子，用手指轻轻弹击管壁管壁混合混合反应液反应液离心离心10S10S将离心管放入将离心管放入PCRPCR仪上，设置好仪上，

6、设置好循环程序进行循环程序进行反应反应四、操作提示四、操作提示 操作提示操作提示 1 1为避免外源为避免外源DNADNA等因素的污染，等因素的污染，PCRPCR实验中使用的微实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行行高压灭菌高压灭菌。 2 2PCRPCR所用的缓冲液和酶应所用的缓冲液和酶应分装成小份分装成小份，并在，并在-20-20储储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢冰块上缓慢融化。融化。 3 3在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂在微量离心管中添加反应成分时，

7、每吸取一种试剂后，移液器上的后，移液器上的枪头都必须更换。枪头都必须更换。 4.4.所有的成分都加入后，盖严离心管口的盖子，所有的成分都加入后，盖严离心管口的盖子，用手指用手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液混合均匀轻轻弹击管的侧壁，使反应液混合均匀，再离心约，再离心约10s10s，使反应液集中在离心管底部，再放入，使反应液集中在离心管底部，再放入PCRPCR仪中进行仪中进行反反应。应。目的：目的：避免避免外源性外源性DNA大量扩增造成大量扩增造成假阳性反应假阳性反应。体内体内DNA复制与复制与PCR的技术区别：的技术区别：体内复制体内复制PCRPCR技术技术解旋解旋在解旋酶作用下，细在解旋酶作用下

8、，细胞提供胞提供ATPATP，部分解开，部分解开加热到加热到9494o oC,C,双链全双链全部解开，不需解旋酶部解开，不需解旋酶引物引物一小段一小段RNARNA一般用一般用DNADNA片段片段DNADNA聚合酶聚合酶细胞自身的细胞自身的DNADNA聚合酶聚合酶（不耐高温）（不耐高温）TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶复制特点复制特点半保留复制，边解旋半保留复制，边解旋边复制，多起点复制。边复制，多起点复制。半保留复制，完全解半保留复制，完全解旋后复制，从模板链旋后复制，从模板链的一端开始复制。的一端开始复制。复制的方向复制的方向 子链的子链的55端向端向 3 3端端延伸延伸子链的子链的55

9、端向端向 3 3端延伸端延伸课堂小结课堂小结多聚酶链式反应扩增多聚酶链式反应扩增DNA片段片段PCR原理原理DNA的复制需要酶、原料、能量、引物的复制需要酶、原料、能量、引物DNA的变性和复性受温度影响的变性和复性受温度影响PCR过程过程变性变性复性复性延伸延伸操作步骤操作步骤配制配制PCR反应体系反应体系移入离心管移入离心管放入放入PCR设置工作参数设置工作参数DNA扩增扩增测定含量测定含量稀释稀释调零调零测定并读数测定并读数计算计算练习巩固练习巩固1、关于、关于PCR技术的应用，错误的一项是技术的应用，错误的一项是A 古生物学、刑侦破案、古生物学、刑侦破案、DNA序列测定序列测定B 诊断遗

10、传疾病、基因克隆、古生物学诊断遗传疾病、基因克隆、古生物学C DNA序列测定、基因克隆、刑侦破案序列测定、基因克隆、刑侦破案D 诊断遗传疾病、合成核苷酸、诊断遗传疾病、合成核苷酸、DNA序列序列测定测定2、DNA的合成方向总是从子链的哪一的合成方向总是从子链的哪一端向哪一端延伸？端向哪一端延伸？3、PCR技术最突出的优点是技术最突出的优点是A 原理简单原理简单 B 原料易找原料易找C TaqDNA聚合酶有耐热性聚合酶有耐热性D 快速、高效、灵活、易于操作快速、高效、灵活、易于操作从子链的从子链的5端向端向3端延伸端延伸4、做、做PCR使用的微量离心管、枪头、缓冲使用的微量离心管、枪头、缓冲液及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是液及蒸馏水使