杨浦五角场新王牌补习班分解纤维素的微生物的分离

1、第4课时分解纤维素的微生物的分离目标导读1.掌握纤维素酶的种类和作用及纤维素分解菌的筛选方法。 2.理解并掌握纤维素分解菌的筛选过程及刚果红染色法的原理。 3.掌握纤维素酶的测定方法。重难点击1.简述纤维素酶的种类及作用。2.掌握从土壤中分离某种特定微生物的操作技术。3.分析分离分解纤维素的微生物的实验流程，弄懂实验操作的原理。一纤维素分解菌的筛选的原理1.纤维素与纤维素酶(1)纤维素据图，纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是地球上含量最丰富的多糖类物质。棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物。纤维素能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。(2)纤维素酶组成：

2、一种复合酶，它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。作用(3)实验验证试管滤纸条缓冲溶液纤维素酶(7080 U/mL)条件结果11×6 cmpH4.8的0.1 mol/L醋酸醋酸钠缓冲溶液10 mL1 mL两试管固定在50 mL锥形瓶中，在摇床上以140 r/min的转速振荡反应1 h时间足够长，滤纸被完全分解21×6 cmpH4.8的0.1 mol/L醋酸醋酸钠缓冲溶液11 mL基本无变化1个酶活力单位是指在温度为25 ，其他反应条件最适宜情况下，在1 min内转化1_mmol的底物所需要的酶量。实验是如何构成对照的？答案在一支试管中添加纤维素酶，另一支试管不添

3、加纤维素酶；尽管醋酸醋酸钠缓冲液用量不同，但都能维持相同的pH。2.纤维素分解菌的筛选(1)方法：刚果红染色法。常用的有两种方法，一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应；另一种是在倒平板时就加入刚果红。(2)原理：刚果红纤维素红色复合物纤维素被分解，出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。归纳提炼两种刚果红染色法的比较项目内容方法一方法二过程培养基上长出菌落覆盖质量浓度为1 mg/mL的CR溶液倒去CR溶液加入NaCl溶液倒掉NaCl溶液出现透明圈配制CR溶液灭菌按照1 mL CR/200 mL培养基比例混匀倒平板培养出现透明圈优点显示出颜色反应基

4、本上是纤维素分解菌的作用操作简便，不存在菌落混杂问题缺点制作繁琐，加入刚果红会使菌落之间发生混杂由于琼脂、土豆汁中均含有淀粉类物质，可能使产生淀粉酶的微生物也形成透明圈，即假阳性反应；有些微生物具有降解色素的能力，它们会降解刚果红形成透明圈，与纤维素分解菌不易区分1.微生物体内能够使纤维素分解成纤维二糖的酶是()A.C1酶和CX酶 B.C1酶和葡萄糖苷酶 C.CX酶和葡萄糖苷酶 D.C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶问题导析纤维素是在C1酶和CX酶的作用下被分解为纤维二糖，葡萄糖苷酶可以将纤维二糖分解为葡萄糖。解析纤维素酶属于复合酶，至少包含C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶三种组分。其中C1酶和CX酶使纤维

5、素分解成纤维二糖。2.鉴定纤维素分解菌时，可以使用刚果红对其染色，刚果红染色法有两种常用方法，两种刚果红染色法的结果是()A.均会出现透明圈 B.方法一出现，方法二不出现C.均不会出现透明圈 D.方法一不出现，方法二出现问题导析刚果红可以跟纤维素结合形成红色复合物，加入纤维素酶后纤维素被分解，不能形成红色复合物，从而出现透明圈。两种方法都能使纤维素分解，都能形成透明圈。解析两种刚果红染色法染色的时间不同，但结果一样，均出现透明圈。二实验设计与操作提示结合实验原理和教材给出的资料，完成下面的实验方案流程图。1.实验过程分析：选择富含纤维素的环境，如树林中多年形成的腐殖土：将样品涂布到鉴别纤维素分

6、解菌的培养基上：刚果红染色法，挑选产生透明圈的菌落2.两种培养基纤维素分解菌的选择培养基配方1纤维素粉5 gNaNO31 gNa2HPO4·7H2O1.2 gKH2PO40.9 gMgSO4·7H2O0.5 gKCl0.5 g酵母膏0.5 g水解酪素0.5 g将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL鉴别纤维素分解菌的培养基配方2CMCNa510 g酵母膏1 gKH2PO40.25 g琼脂15 g土豆汁100 mL将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL(1)从功能上来看，培养基配方1为纤维素分解菌的选择培养基，该培养基中的唯一碳源是纤维素粉，只有能利用它的纤

7、维素分解菌才能生存；培养基配方2为纤维素分解菌的鉴别培养基。在该培养基中加入刚果红溶液，当培养基中长出菌落后，由于在该培养基上生长的只能是纤维素分解菌，能分泌纤维素酶，因此菌落周围会形成透明圈。(2)从物理性质上来看，培养基配方1为纤维素分解菌的液体培养基，利用这种培养基可以增加纤维素分解菌的浓度；培养基配方2为纤维素分解菌的固体培养基，原因是添加了琼脂成分，需要在培养基上形成我们肉眼可见的菌落。(3)若设置一个对照实验说明选择培养的作用，应控制的变量是将纤维素粉改为葡萄糖。3.结果分析与评价(1)培养基的制作是否合格：对照的培养基在培养过程中没有菌落生长，则说明培养基制作合格。(2)选择培养

8、基是否筛选出菌落：如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。(3)分解的结果是否一致：由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，学生也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。4.课题延伸(1)为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验，纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵两种。(2)纤维素酶的测定方法：一般是采用对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖含量进行定量测定。归纳提炼纤维素分解菌的选择培养基和鉴别培养基的区别(1)纤维素分解菌的选择培养基为液体培养基，因培养基中无凝固剂，利用液体选

9、择培养基以增加纤维素分解菌的浓度。(2)能产生纤维素酶的微生物能以纤维素作为碳源和能源，在培养基中正常生长，其他绝大多数生物不能正常生长。(3)鉴别培养基中含有琼脂，为固体培养基，刚果红染色法应用的就是此培养基。1.下列关于分离纤维素分解菌的实验的叙述，错误的是()A.经选择培养后将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上B.选择培养这一步可省略，但培养纤维素分解菌少C.经稀释培养后，用刚果红染色D.对照组可用同样量的培养液涂布到不含纤维素的培养基上问题导析经选择培养后的样品需经梯度稀释后，才能涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上。解析经选择培养后，再经稀释，才能将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上

10、；选择培养可省略；经稀释培养后，用刚果红染色；设置对照能证明经选择培养的确得到了欲分离的微生物。2.鉴别培养基是根据微生物的代谢特点在培养基中加入一些物质配制而成的，这些物质是()A.指示剂或化学药品 B.青霉素或琼脂C.高浓度食盐 D.维生素或指示剂问题导析鉴别培养基是在培养基中加入某种试剂或化学药品，使培养后会发生某种变化，从而区别不同类型的微生物；培养基中加入青霉素或高浓度食盐的目的是抑制某些微生物的生长；琼脂为凝固剂。解析在培养基中加入青霉素或高浓度食盐的目的是抑制某些微生物的生长，而加维生素一般是为微生物提供生长因子，起不到选择或鉴别作用，只有在加入某种指示剂或化学药品后，某些微生物

11、会与特定的化学物质发生特定的化学反应，而表现出特有的菌落特征，我们可以根据这些特征去判断属于哪种微生物。1.在加入刚果红的培养基中出现透明圈的菌落是()A.分解尿素的细菌 B.硝化细菌C.分解纤维素的细菌 D.乳酸菌解析分解纤维素的细菌能将纤维素分解，刚果红纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。2.不能够与刚果红反应生成红色复合物的是()A.纤维二糖 B.纤维素C.CMCNa D.淀粉解析刚果红可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但不与纤维二糖、葡萄糖、麦芽糖等发生反应。3.下列对刚果红染色法的叙述，不正确的是()A.可以先培养微生物，再加入刚果红进行颜

12、色反应B.可以在倒平板时就加入刚果红C.既可以先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，也可以在倒平板时就加入刚果红D.可以将刚果红与培养基中其他物质一起放入培养基后再灭菌倒平板解析刚果红染色法一般有两种：一种是先培养微生物长出菌落后，再加入刚果红进行颜色反应，然后加入一定浓度的NaCl溶液将多余的刚果红带走；一种是配制好培养基灭菌后，倒平板时加入灭菌处理的刚果红，再接种微生物培养直至产生透明圈。4.植物秸秆中的纤维素可被某些微生物分解。回答下列相关问题：(1)分解秸秆中纤维素的微生物能分泌纤维素酶，该酶是至少由3种组分形成的复合酶，其中的葡萄糖苷酶可将_分解成_。(2)在含纤维素的培养基中加入

13、刚果红(CR)染料时，CR可与纤维素形成_色复合物。用含有CR的该种培养基培养纤维素分解菌时，培养基上会出现以该菌的菌落为中心的_。(3)为从富含纤维素的土壤中分离获得纤维素分解菌的单菌落并加以鉴定，某同学设计了甲、乙两种培养基：酵母膏无机盐淀粉纤维素粉琼脂CR溶液水培养基甲培养基乙注：“”表示“有”，“”表示“无”。据表判断，培养基甲_(填“能”或“不能”)用于分离纤维素分解菌，原因是_；培养基乙_(填“能”或“不能”)用于鉴定纤维素分解菌，原因是_。答案(1)纤维二糖葡萄糖(2)红透明圈(3)不能液体培养基不能分离单菌落不能培养基中没有纤维素解析(1)纤维素酶中的葡萄糖苷酶能将纤维二糖分解

14、成葡萄糖。(2)在含纤维素的培养基中加入刚果红(CR)染料时，CR可与纤维素形成红色复合物，并不与水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应，所以用含有CR的培养基进行培养时，会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。(3)根据表格中的相关信息甲不能做为分离纤维素分解菌，因为其中没有琼脂，液体培养基是不能分离单菌落的。培养基乙不能用于分离纤维素分解菌，因为培养基中没有纤维素，无法形成红色复合物，无法筛选。基础过关知识点一纤维素分解菌的筛选的原理1.纤维素酶可以将下列哪种物质分解()A.牛肉片 B.鱼片C.滤纸条 D.塑料条解析纤维素酶只能使纤维素分解，本题中只有C项滤纸条的主要成分是纤维素，所以可以将滤纸

15、条分解。2.选择培养基是根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或对一些物理、化学抗性而设计的培养基。利用这种培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。为选择酵母菌和硝化细菌，应选用的培养基分别为()A.伊红美蓝培养基、含青霉素培养基B.含青霉素培养基、含氨的无机培养基C.含氨的无机培养基、含青霉素培养基D.含青霉素培养基、伊红美蓝培养基解析酵母菌是真菌，通常可以用含青霉素的培养基进行选择培养，因为青霉素抑制细菌生长，但不抑制真菌生长。硝化细菌为自养型生物，能够利用氨转变为亚硝酸和硝酸所释放的能量，把无机物转变为有机物以维持自身生命活动，利用含氨的无机培养基可进行选择培养。3.刚果红是

16、一种酸性染料，能将下列哪些物质染色()纤维二糖葡萄糖纤维素苏木精弹性纤维A. B.C. D.解析刚果红是一种酸性染料，可与纤维素反应形成红色复合物，在动物组织制片中用来染神经轴、弹性纤维、胚胎材料等，在植物制片中可以跟苏木精作二重染色。4.要将能分解纤维素的细菌从土壤中分离出来，应将它们接种在()A.加入伊红美蓝的鉴别培养基上B.含有蛋白胨的固体培养基上C.只含纤维素粉而无其他碳源的选择培养基上D.含四大营养要素的培养基上解析要把纤维素分解菌从土壤中分离出来，就要选择能使纤维素分解菌生存，但其他微生物不能生存的选择培养基进行培养，其选择条件是以纤维素粉作为唯一碳源。在该培养基上，只有能分解纤维

17、素的细菌能够生存，其他微生物因不能利用纤维素而不能生存。知识点二实验设计与操作提示5.从土壤中筛选纤维素分解菌的实验设计，正确的是()A.土壤取样梯度稀释稀释涂布平板挑选菌落B.土壤取样选择培养稀释涂布平板挑选菌落C.土壤取样梯度稀释选择培养挑选菌落D.土壤取样梯度稀释稀释涂布平板选择培养挑选菌落正确的流程是“土壤取样选择培养稀释涂布平板挑选菌落”，其中选择培养的目的是增加纤维素分解菌的浓度，因此需要在稀释涂布平板之前进行，最后根据菌落的特征挑选纤维素分解菌。6.在加入刚果红的培养基中会出现透明圈，产生的透明圈是()A.刚果红与纤维素形成的复合物B.刚果红与纤维二糖形成的复合物C.纤维素分解后

18、形成的葡萄糖导致的D.以纤维素分解菌为中心形成的解析刚果红可以与纤维素结合形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。7.在将样品稀释涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上之前一般先进行选择培养，其主要目的是()A.完全除去其他微生物B.没有意义，去掉这一步更好C.增加纤维素分解菌的浓度D.使纤维素分解菌充分长大解析纤维素分解菌如果在所采集的土样中含量少，稀释涂布到鉴别培养基上后形成的菌落数少，不利于挑选所需菌落，通过选择培养可以增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需

19、要的微生物。8.通过分离分解纤维素的微生物实验，对分解纤维素的微生物进行了初步的筛选，这只是分离提纯的第一步，还需要进行()A.发酵产纤维素酶的实验B.提取纤维二糖的实验C.浓缩纤维素分解菌的实验D.提取葡萄糖的实验解析对纤维素分解菌的鉴定，常用的方法是对分离的菌种进行发酵产纤维素酶的实验。能力提升9.使用刚果红染色时，加入刚果红可以在()制备培养基时梯度稀释时倒平板时涂布时长出菌落后A. B.C. D.解析常用的刚果红染色法有两种，一种是先培养微生物，长出菌落后再加入刚果红进行颜色反应；另一种是倒平板时就加入刚果红。最终，两种染色法都可以在培养基上观察到以纤维素分解菌为中心的透明圈。10.下

20、列生物能分解纤维素的是()人兔牛蘑菇纤维杆菌A. B. C. D.解析兔、牛为食草动物，其肠道内有分解纤维素的微生物，蘑菇、纤维杆菌能分泌纤维素酶分解纤维素；而人不能消化纤维素。11.下列有关刚果红染色法的叙述，不正确的是()A.刚果红可以在细菌菌落形成前倒平板时加入B.刚果红可以在菌落形成后加入C.刚果红在菌落形成前倒平板时加入，加入的刚果红不需要灭菌D.在菌落形成后加入刚果红时，刚果红不需要灭菌解析刚果红可以与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，红色复合物无法形成，出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。刚果红可以在细菌菌落形成前倒平板时

21、加入，也可以在菌落形成后加入。若在细菌菌落形成前倒平板时加入刚果红，则所加刚果红要进行灭菌，以防杂菌的侵入，影响纤维素分解菌菌落的形成；若在菌落形成后加入刚果红，则不需要灭菌。12.在对纤维素分解菌进行选择培养时，用液体培养基的目的是()A.可获得大量菌体B.纤维素分解菌适宜在液体培养基上生长C.可以充分利用培养基中的营养物质D.可获得高纯度的纤维素分解菌解析不同物理形态的培养基其作用不一样，固体培养基用于菌种的分离、鉴定、菌落计数、菌种保藏等；液体培养基可用于获得大量菌体。13.下列有关纤维素分解菌的分离的叙述，不正确的是()A.纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵B.对纤维素分解菌进行初

22、步筛选后，无需再进行其他实验C.纤维素酶的测定方法，一般是对所产生的葡萄糖进行定量的测定D.纤维素酶是一种复合酶解析初步筛选只是分离纯化的第一步，为确定得到的是纤维素分解菌，还需要进行发酵产生纤维素酶的实验。14.下图为分离并统计分解纤维素的微生物的实验流程，据此回答有关问题：(1)要从富含纤维素的环境中分离纤维素分解菌，从高温热泉中寻找耐热菌，这说明_。(2)在将样品接种到鉴别纤维素分解菌的培养基上之前，可通过选择培养增加纤维素分解菌的浓度，某同学根据需要配制了纤维素分解菌的培养基如下表。整个实验过程严格无菌操作，如果将其中的纤维素粉换成_，菌落数_，即可说明选择培养基的作用。成分含量纤维素

23、粉5.0 gNaNO31.0 gNa2HPO4·7H2O1.2 gKH2PO40.9 gMgSO4·7H2O0.5 gKCl0.5 g酵母膏0.5 g水解酪素0.5 g蒸馏水定容至1 000 mL(3)接种微生物最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法，本实验宜采用_法，原因是_。解析在寻找目的微生物时要根据目的菌株对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找；微生物的选择培养就是根据微生物的不同特点，在培养基中加入某些物质，允许一部分微生物的生存，而抑制另一部分微生物的生长。在本实验中，由于只有纤维素分解菌才能利用培养基中的纤维素，因此只含有纤维素粉的培养基为选择培养基，而葡萄糖是

24、许多微生物都能利用的碳源，因此通常用葡萄糖来配制完全培养基，在选择培养基上生长的微生物种类少，菌落数就少；微生物的分离的接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法，因为这两种方法都能使菌体分散到培养基的表面，但是平板划线法不能确定接种量，而稀释涂布平板法可以确定接种量，因此平板划线法不能根据稀释液体积计算每克样品中的菌株数。15.虽然现在大力提倡无纸化办公，但是每年仍然不可避免地要产生大量的废纸，其主要成分是木质纤维，人类正努力将其转化为一种新的资源乙醇。如图是工业上利用微生物由纤维素生产乙醇的基本工作流程，请回答相关问题：(1)自然界中环节需要的微生物大多分布在_的环境中。将从土壤中获得的微生物培养在以_为唯一碳源、并加入_的培养基上筛选周围有_的菌落。(2)如上所述的筛选中获得了三个菌落，对它们分别培养，并完成环节，且三种等量酶液中酶蛋白浓度相同，则你认为三种酶液的活性_(一定相同、不一定相同、一定不同)，可以通过_进行定量测定。(3)根据测定结果，环节常选