微生物与重金属之间的相互关系

1、微生物与重金属之间的相互关系报告人：主要内容 1.微生物的定义及其分类 2. 微生物对重金属活性的影响 3. 重金属胁迫条件下对微生物多样性的影响 4. 目前研究中存在的问题 5. 该领域研究采用的新技术 6.结语一、什么是微生物？微生物非细胞性微生物原核细胞型微生物 真核细胞型微生物1.病源微生物八大类立克次体衣原体支原体螺旋体放线菌病毒真菌细菌微生物微生物 H5N1禽流感病毒非细胞型微生物1.无细胞结构，结构最简单，体积最微小，能通过细菌滤器；2.由单一核（DNA或RNA）和蛋白质外壳组成；3.必须寄生在活的易感细胞内必须寄生在活的易感细胞内生长繁殖。生长繁殖。 2.原核细胞型微生物1.1

2、.仅有原始核，无仅有原始核，无核膜、无核仁，染核膜、无核仁，染色体仅为单个；色体仅为单个；2.缺乏完整的细胞器。 肠道细菌放线菌3.真核细胞型微生物1.细胞核分化程度较高，有典型的核结构（有核膜、核仁、多个染色体，由DNA和组蛋白组成）；2.通过有丝分裂进行繁殖；3.胞浆内有多种完整的细胞器。 真菌二、微生物对重金属活性的影响 微生物对重金属活性的影响主要是通过微生物对重金属的吸附、迁移及转化来实现的。1.微生物对重金属的吸附：主要从下列三方面来研究 吸附机理；吸附机理； 吸附方式；吸附方式； 影响吸附量多少的因素。影响吸附量多少的因素。 吸附机理吸附机理活细胞吸附死细胞死细胞吸附吸附如革兰氏

3、阳性细菌如革兰氏阳性细菌（细胞壁的结构）（细胞壁的结构）真菌的细胞壁真菌的细胞壁（成分）（成分）离子泵、载体协助、离子泵、载体协助、脂类过度氧化和复合脂类过度氧化和复合物渗透物渗透PHPH、温度适宜、温度适宜的条件下的条件下具有较具有较高的吸高的吸附量附量革兰氏染色类型细胞壁厚度细胞壁化学组合细胞壁结构中功能团 菌毛革兰氏阳性菌20-80nm90%肽聚糖、肽聚糖、10%磷壁酸，不含或很磷壁酸，不含或很少含脂多糖少含脂多糖表面功能团丰富如羧基、羟基、磷酸基等，等电点各异 很少有革兰氏阴性菌15-20nm肽聚糖站细胞壁的10%，不含磷壁酸 同上细胞表面长有菌毛成分为菌毛蛋白，疏水性沈萍主编. 微生

4、物学M, 北京：高等教育出版社， 2000目前常用于吸附重金属离子的微生物数量众多（表1）孙嘉龙，李梅，曾德华 . 微生物对重金属的吸附、转化作用. 贵州农业科学，2007，35（5）；147150孙嘉龙，李梅，曾德华 . 微生物对重金属的吸附、转化作用. 贵州农业科学，2007，35（5）；147150静电吸附表面络合离子交换吸附重金属细胞壁结构离子与溶液中离子（正负电荷吸附）吸附方式两大主要因素: pH、温度注意：如果是培养微生物如果是培养微生物 菌种的选取，溶液的配制，试验方法的应用，培养时间的长短，吸附方法的采取，碱处理的过程都会使培养基中的碳氮比、pH、温度产生变化，从而影响培养基中

5、微生物对重金属的吸附效果。 如下表是关于培养基中如下表是关于培养基中pH、温度等对重金属吸附效果的、温度等对重金属吸附效果的分析分析李清彪,吴涓,杨宏泉,等.白腐真菌菌丝球形成的物化条件及其对铅的吸附J.环境科学,1999,20(1):34239PH值的影响如白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium)吸附Pb2+的研究表明，28和35时的吸附率分别为95.62%和94.81%，但40时的吸附率降为82.49%。温度的影响注意的是注意的是：在适宜菌体生长的温度范围内，温度对微生物吸：在适宜菌体生长的温度范围内，温度对微生物吸附重金属效率的影响不大。附重金属效率的影响不大。

6、 如康春莉等发现在温度低于30时，温度对Pb2+、Cd2+的吸附没有影响；当温度高30时，吸附量略有下降，这肯能是因为温度过高影响了胞外络合物的活性导致的。 当溶液中存在其他金属离子时，这些共存离子与主要离 子竞争细胞上有限的带负电荷的基团，一般都会抑制主要 金属离子的吸收，从而导致主要金属离子的吸附量的减少。 其它因素的影响: 如周东琴等研究用Cu2+，Pb2+和Hg2+ 3种离子对沟戈登氏菌(Gordona amarae)进行诱导培养如图所示： 图表4、7 李清彪,吴涓,杨宏泉,等.白腐真菌菌丝球形成的物化条件及其对铅的吸附J.环境科学,1999,20(1):34239 从中可以得出若对微

7、生物吸附剂进行一些物理、化学的预处理(如用酸、碱浸泡或加热等方法)，可以不同程度改变其吸附能力。土壤中微生物对重金属的迁移转化的影响机制土壤中微生物对重金属的迁移转化的影响机制 1. 通过烷基化、去烷基化、氧化、还原、配位和沉淀烷基化、去烷基化、氧化、还原、配位和沉淀作用转化重金属，并影响它们的迁移能力和生物有效性2.能大量富集几乎所有的重金属，并通过食物链进入人体，参与生物体内的代谢过程 重金属可与土壤中的有机配位体发生配合作用，影响着土壤中重金属离子的迁移活性。 - 腐殖质中的富里酸与重金属离子形成的螯合物，溶解度较大，易于在土壤中迁移。 -腐殖质中的腐殖酸与重金属形成的螯合物溶解度小，不

8、易在土壤中迁移。土壤中微生物对重金属的迁移转化土壤中微生物对重金属的迁移转化 pH值重金属离子的溶解度迁移能力 土壤的氧化还原状况影响重金属的存在形态，使其溶解度发生变化，从而影响重金属在土壤中的迁移。重金属化合物的溶解度越高迁移能力越强？ 微生物通过三种方式影响重金属的迁移转化微生物通过三种方式影响重金属的迁移转化: 1.主动与被动的堆积、在其体内富集； 2.通过微生物的金属转化作用使重金属的形态发生转化； 3.通过影响重金属的活性，实现不同金属离子间的形态转化。 微生物对重金属迁移转化的方式微生物对重金属迁移转化的方式 如有些微生物可把难溶性的Pu4+还原成可溶性的Pu3+，把Hg2+还原

9、成挥发性的Hg，铁锰氧化物的还原也可把吸附在难溶性Fe3+、Mn4+氧化物上的重金属释放出来。 菌根是土壤中的真菌菌丝与高等植物营养根系形成的一种联合体，具有很强的酸溶和酶解能力，菌根根际分泌物及根际提供的微生态使菌根根际维持较高的微生物种群密度和生理活性，从而促进植物生长。菌根真菌对重金属的影响1）菌根真菌通过分泌特殊的分泌物等形式改变植物根际环境，改变重金属的存在状态，降低重金属毒性；2) 菌根真菌能影响菌根植物对重金属的积累和分配，使菌根植物体内重金属积累量增加，提高植物的富集效果3） 菌根真菌向宿主植物传递营养，使植物幼苗成活率提高，宿主植物抗逆性增强、生长加快，间接地促进植物对重金属

10、的修复作用。菌根的形成也同时影响植物根际微生物的种类和数量。 值得注意的是： 一般认为，重金属污染土壤中的土著菌根真菌耐一般认为，重金属污染土壤中的土著菌根真菌耐受重金属能力较强，植物与菌根真菌生物修复的关受重金属能力较强，植物与菌根真菌生物修复的关键在于筛选有较强降解能力的菌根真菌和适宜的共键在于筛选有较强降解能力的菌根真菌和适宜的共生植物，使两者能相互匹配形成有效的菌根。生植物，使两者能相互匹配形成有效的菌根。三、重金属胁迫下对微生物多样性的影响 植物根系在重金属的胁迫下，可导致分泌物的大量释放植物根系在重金属的胁迫下，可导致分泌物的大量释放 可溶性分泌物，如有机酸、氨基酸、单糖等，可通过

11、螫合作用和还原作用，或通过改变根系区域的pH值和氧化还原状况，增加重金属的溶解性和移动性； 不溶性分泌物，如多糖、挥发性化合物，脱落的细胞组织等则在抵御重金属的毒害作用中起着重要的作用。 1.重金属污染对微生物群落多样性的影响 微生物可以影响重金属的活性，同样重金属在短时期内可以降低微生物的活性，污染严重时还会降低微生物的生物数量。如图所示分析模型1和模型2： 2.土壤重金属污染对微生物功能多样性的影响（1）影响微生物对碳源的利用； （2）降低了微生物的代谢效率； （3）通过16SrDNA-DGGE分析重金属影响微生物的生理结构，但是没有对其遗传多样性构成显著影响； （4）随着重金属污染程度的

12、增加，细菌群落的代谢多样性也逐渐降低。16SrDNA-DGGE16SrDNA-DGGE技术基本路线技术基本路线一一 样品总样品总DNADNA的提取：的提取：1 实验器材：玻璃器材，铝盖，实验器材：玻璃器材，铝盖，1.5mL离心管，螺口管，锆珠，搅离心管，螺口管，锆珠，搅拌器，拌器，4离心机。离心机。实验试剂：实验试剂：PBS（0.05M，pH=7），水饱和酚，），水饱和酚，TE饱和酚，饱和酚，TN150，TE缓冲液，缓冲液，TAE缓冲液，缓冲液，NaAc (pH=5.2),氯仿氯仿/异戊异戊醇（醇（24：1）（）（V/V），），96%冷乙醇，冷乙醇，70%冷乙醇。冷乙醇。3 3 实验操作：细胞

13、分裂、提取实验操作：细胞分裂、提取DNADNA二、二、DNADNA的检测的检测琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳1试剂和器材：试剂和器材： 电泳缓冲液（1*TAE），溴乙锭（EB）染色贮存液（1mg/mL）,0.25%溴酚兰，琼脂糖，双蒸水。电泳仪，水平电泳槽，透射紫外灯，胶带纸 。2.2.实验操作：实验操作：1.2%琼脂糖凝胶的制备、点样、电泳琼脂糖凝胶的制备、点样、电泳 、观察、观察三、三、16s rDNA16s rDNA片段扩增片段扩增1 1 细菌通用引物：细菌通用引物：EUB-968Gc for：5CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG

14、 GGG GAA CGC GAA GAA CCT TAC 3EUB-L1401 rev：5 CGG TGT GTA CAA GAC CC 3 2 2 反应体系：反应体系：反应液组成反应液组成: : 单个样品量、单个样品量、 MQMQ、dNTPdNTP、MgCl2MgCl2、PCRPCR缓冲液、引物缓冲液、引物968Gc for968Gc for、引物、引物L1401 revL1401 rev、Taq DNATaq DNA聚合聚合酶、样品酶、样品DNADNA3 3、反应条件：、反应条件： 1、摸板热变性5min942、摸板热变性10s9456 35个循环683、退火（复性）20s4、延伸40s5

15、、延伸（post-elongation）7min684 产物检测：1.2%琼脂糖凝胶电泳 四四 变性梯度凝胶电泳（变性梯度凝胶电泳（DGGEDGGE） 1 实验试剂及配量实验试剂及配量 ：100%的贮存液、的贮存液、0%的贮存液、缓冲液、的贮存液、缓冲液、固定液、银染溶液、显影剂固定液、银染溶液、显影剂 2 实验操作：玻璃三明治的制备、胶的备制 、电泳 、染色、加固3.土壤重金属污染对微生物遗传多样性的影响 例如： Sandaa等学者通过斑点杂交发现，重金属污染不同的两种土壤，微生物群落结构没有显著差异；但随着重金属浓度的升高，用探针ALF1b、CF319a和LGCb分离的种群比例降低，BET

16、42a、GAM42a、SRB385和HGC69a分离的种群比例增加了；RFLP聚类分析显示，污泥重金属含量高的土壤中细菌多样性指数较高，而克隆文库聚类分析得到相反的结果。研究中存在的问题： 1. 1. 共存金属离子之间存在竞争吸附，但是有时出现协同作用，这共存金属离子之间存在竞争吸附，但是有时出现协同作用，这种作用机制尚不清楚；种作用机制尚不清楚； 2. 2. 研究中，可以通过增加研究中，可以通过增加EPSEPS（胞外络合物）的浓度提高吸附效（胞外络合物）的浓度提高吸附效率，但是当率，但是当EPSEPS达到最大吸附浓度时，提高吸附效率需要通过怎达到最大吸附浓度时，提高吸附效率需要通过怎样的手段

17、需要进一步研究；样的手段需要进一步研究； 3. 3. 由于由于EPSEPS的多少随着微生物的生长发育而变化，因此怎样更好的多少随着微生物的生长发育而变化，因此怎样更好地控制微生物生长过程中的地控制微生物生长过程中的EPSEPS需要更深的研究；需要更深的研究； 4.研究中选择的微生物的数量还是有限的，有待于扩大多更多微生物的研究；5.多数研究者只是对重金属污染影响微生物多样性的作用进行了现象描述,深层次的机理研究还相对缺乏,有必要从群落、个体、分子、基因等不同层次开展相关研究。 目前该领域的研究技术 目前重金属污染已经成为一个日益严重的环境问题，研究微生物与重金属之间的相互关系具有至关重要的作用，目前该领域研究采用的技术主要有: 1.通过16srRNA的基因扩增后测序，从而判断菌株的种类，通过高通量的方法来研究重金属胁迫下对微生物的多样性的影响。2.以群 落水平碳 源 利用类 型 为基础 的B1oLoG氧化还原技术来研究土壤微生物群落功能多样性。 3.形态学分析技术：荧光显微镜细胞结构分析：生物标记分子 （用高效气相色谱定量分析）4.分子生物学方法： 核酸探针检测技术、引物扩增技术、电泳分离技术、微生物酶测定的方法（如蛋白酶、脲酶、纤维素酶等活性测定方法）、 MAR-FISH（显微放射自显影荧光原位杂交），STAR-FISH（底物