生物制药工艺学实验课件2

1、南京师范大学生命科学学院南京师范大学生命科学学院张茵张茵20152015年年4 4月月实验二 柱层析法提取溶菌酶实验目的掌握静态和动态离子交换的方法；掌握静态和动态离子交换的方法；掌握从生物材料中提取活性蛋白质方法。掌握从生物材料中提取活性蛋白质方法。实验材料起始缓冲液：起始缓冲液： 0.1M 磷酸钠缓冲液（pH7.0）洗脱液：洗脱液： 50mM NaCl溶液200mL（溶剂：起始缓冲液） 500mM NaCl溶液150mL（溶剂：起始缓冲液）l再生溶液：再生溶液：0.5M NaOH溶液仪器：仪器：磁力搅拌器等磁力搅拌器等其他材料：其他材料：新鲜鸡蛋新鲜鸡蛋实验流程样品的预处理样品的预处理静态

2、吸附和洗涤静态吸附和洗涤动态洗脱杂质和溶菌酶动态洗脱杂质和溶菌酶再生树脂再生树脂洗涤管道洗涤管道背景知识蛋清中的溶菌酶蛋清中的溶菌酶 一种碱性球蛋白一种碱性球蛋白，MwMw14700Da14700Da， pIpI10.511.010.511.0，在酸性条件在酸性条件下（下（pH4pH47 7）较耐热，而在中、碱性条件下热稳定性较差。）较耐热，而在中、碱性条件下热稳定性较差。 蛋清中主要的蛋白质蛋清中主要的蛋白质 卵白蛋白，占卵白蛋白，占5454，pIpI4.54.54.84.8，分子量约为，分子量约为 45000Da45000Da； 卵伴白蛋白，卵伴白蛋白，pIpI6.056.056.66.6

3、，分子量约为，分子量约为 7000078000Da7000078000Da； 卵球蛋白，卵球蛋白，pIpI5.55.85.55.8，分子量约为，分子量约为360003600045000Da45000Da； 卵类粘蛋白，卵类粘蛋白，pIpI3.93.94.34.3，分子量约为，分子量约为28000Da28000Da； 卵粘蛋白粘度较大且不溶于水。卵粘蛋白粘度较大且不溶于水。实验原理蛋清中的蛋白质大多数呈酸性或者弱酸性，在蛋清中的蛋白质大多数呈酸性或者弱酸性，在pHpH7.07.0的条件下，这些蛋白质的条件下，这些蛋白质带负电荷或者少量的正电带负电荷或者少量的正电荷荷；而等电点约为；而等电点约为1

4、1.011.0的溶菌酶的溶菌酶带正电荷带正电荷，牢固地，牢固地吸附在阳离子交换树脂上，再通过吸附在阳离子交换树脂上，再通过不同离子强度的不同离子强度的 NaClNaCl溶液将弱酸性蛋白质和溶菌酶溶液将弱酸性蛋白质和溶菌酶分级洗脱分级洗脱下来。下来。离子交换层析分离溶菌酶离子交换层析分离溶菌酶Na+ 阳离子交阳离子交换树脂换树脂阳离子交阳离子交换树脂换树脂阳离子交阳离子交换树脂换树脂+-静态和动态离子交换法l 静态离子交换法静态离子交换法优点：优点：操作简单；操作简单；设备要求低；设备要求低；适合于粘度较高适合于粘度较高的样品。的样品。 缺点：缺点： 交换不完全；交换不完全；不适宜用作多种不适宜

5、用作多种成分的分离；成分的分离； 而且树脂有一定而且树脂有一定的损耗。的损耗。动态离子交换法动态离子交换法优点：优点：分辨率高，适分辨率高，适合多组分样品合多组分样品的分离；的分离；交换完全；交换完全；洗脱液中溶质洗脱液中溶质浓度高；浓度高；缺点：缺点：设备要求高；设备要求高；操作参数多。操作参数多。洗脱 改变离子强度，在缓冲液中加入适改变离子强度，在缓冲液中加入适当的当的KClKCl、NaClNaCl等非缓冲盐类等非缓冲盐类 改变改变pHpH值，用缓和的酸或者碱洗脱值，用缓和的酸或者碱洗脱。分阶段分阶段梯度洗脱：梯度洗脱：先采用先采用洗脱能力弱洗脱能力弱的溶的溶液，使易解吸附的组分流出，然后

6、依次使用液，使易解吸附的组分流出，然后依次使用洗脱能力强洗脱能力强的溶液，解吸附较难洗脱的组分。的溶液，解吸附较难洗脱的组分。连续梯度洗脱：连续梯度洗脱：其洗脱效果优于分阶段梯其洗脱效果优于分阶段梯度洗脱，适合于度洗脱，适合于高分辨率高分辨率的分离目的，或者的分离目的，或者摸索分阶段梯度洗脱的条件。摸索分阶段梯度洗脱的条件。离子强度离子强度分阶段洗脱分阶段洗脱连续洗脱连续洗脱离子强度离子强度洗脱峰洗脱峰洗脱峰洗脱峰连续梯度洗脱的装置连续梯度洗脱的装置 C = C C = CB B - -（C CB B - C- CA A）（）（1 - V1 - V2 2/V/V1 1）B1/A1B1/A1 C

7、 CA A 、C CB B 梯度混合器梯度混合器A A瓶、瓶、 B B瓶的浓度；瓶的浓度； A1 A1 、B1 B1 A A瓶、瓶、B B瓶的横切面积；瓶的横切面积； V V2 2流经层析柱的体积，流经层析柱的体积，V V1 1梯度洗脱液的总体积。梯度洗脱液的总体积。总结离子交换的操作流程离子交换的操作流程树脂的选择（阳离子交换树脂还是阴离子交换树脂的选择（阳离子交换树脂还是阴离子交换树脂）树脂）树脂的预处理（盐型还是氢型、羟型）树脂的预处理（盐型还是氢型、羟型）缓冲液的种类、缓冲液的种类、pHpH值和离子强度值和离子强度洗脱洗脱树脂的再生树脂的再生离子交换的操作参数离子交换的操作参数流速（吸

8、附的速度和洗脱速度）流速（吸附的速度和洗脱速度）样品的体积和浓度样品的体积和浓度实验步骤样品的预处理样品的预处理 取取2 2个新鲜鸡蛋，在其一端敲一个小洞，收集蛋清，加入约其体积个新鲜鸡蛋，在其一端敲一个小洞，收集蛋清，加入约其体积1.51.5倍倍的起始缓冲液，搅拌均匀，用的起始缓冲液，搅拌均匀，用4 4层纱布过滤除去不溶性物质，层纱布过滤除去不溶性物质，检查其检查其pHpH值是否为值是否为7.07.0，否则用，否则用0.5M0.5M酸、碱调节。酸、碱调节。静态吸附和洗涤静态吸附和洗涤静态吸附溶菌酶：静态吸附溶菌酶：倾出层析柱中平衡好的树脂，倾去多余平衡缓冲液，倾出层析柱中平衡好的树脂，倾去多

9、余平衡缓冲液，将蛋清溶液倒入树脂中，在磁力搅拌器上将蛋清溶液倒入树脂中，在磁力搅拌器上轻轻搅拌轻轻搅拌，室温下搅拌吸附，室温下搅拌吸附约约45min45min，注意搅拌速度（勿起大量泡沫、勿打破树脂）。吸附结束，注意搅拌速度（勿起大量泡沫、勿打破树脂）。吸附结束，吸取吸取 200L 200L 上清于上清于 dorfdorf管中、管中、4 4度保存备用（度保存备用（标记标记“1 1”），倾倒上），倾倒上清。清。洗涤杂质：洗涤杂质：取取与树脂体积相当与树脂体积相当的起始缓冲液的起始缓冲液搅拌洗涤树脂约搅拌洗涤树脂约5min5min，重重复复2 2次次，每次洗涤后，吸取，每次洗涤后，吸取 200L

10、200L 洗涤液于洗涤液于 dorfdorf管中、管中、4 4度保存备用度保存备用（标记标记“2”2”“3”3”），倾去洗涤液。），倾去洗涤液。 动态洗脱动态洗脱用少量起始缓冲液将树脂调匀，重新装填层析柱，用少量起始缓冲液将树脂调匀，重新装填层析柱，装填结束后，用起始缓冲液（装填结束后，用起始缓冲液（用滴管沿层析柱内壁用滴管沿层析柱内壁缓缓加入，勿冲击树脂面，高度约缓缓加入，勿冲击树脂面，高度约2cm2cm即可即可）封闭树）封闭树脂面，将层析系统组装好，核酸蛋白检测仪调基线脂面，将层析系统组装好，核酸蛋白检测仪调基线（T T档调档调“100”100”，A A档调档调“0”0”），开始用），开始

11、用 50mM 50mM NaClNaCl洗脱液洗脱液恒速洗脱杂质恒速洗脱杂质。（流速约。（流速约23mL/min)23mL/min)2.2. 洗脱杂蛋白：洗脱杂蛋白：洗脱开始，即计时，然后洗脱开始，即计时，然后每隔每隔2min2min，记录下吸光值，记录下吸光值和电和电导率值（使用导率值（使用LPLP层析系统的同学记录电导率值），当层析系统的同学记录电导率值），当洗脱峰结束洗脱峰结束（流出液的吸光值从开始上升到下降，直至平稳流出液的吸光值从开始上升到下降，直至平稳），洗脱完成。），洗脱完成。在在洗脱峰洗脱峰吸光值最大处吸光值最大处收集少量洗脱液于收集少量洗脱液于 dorfdorf管管中，中，标

12、记标记“4 4”）3.3. 收集溶菌酶：收集溶菌酶：更换更换 500mM NaCl500mM NaCl洗脱液洗脱液，同样记录，同样在吸光值最，同样记录，同样在吸光值最大处收集少量洗脱液于大处收集少量洗脱液于dorfdorf管中，管中，标记标记“5 5”），），此时是此时是溶菌酶的洗脱峰，所以溶菌酶的洗脱峰，所以整个洗脱峰要收集于烧杯中，整个洗脱峰要收集于烧杯中，4 4度保存度保存。再生树脂再生树脂 用用0.5M NaOH0.5M NaOH溶液（约溶液（约1 1倍柱床体积）洗涤树脂，然后倍柱床体积）洗涤树脂，然后用蒸馏水将碱液冲洗干净，树脂回收于烧杯中，浸泡用蒸馏水将碱液冲洗干净，树脂回收于烧杯中，浸泡于蒸馏水中，保鲜膜蒙好，室温放置。于蒸馏水中，保鲜膜蒙好，室温放置。l洗涤管道洗涤管道 将管道系统连接好，用约将管道系统连接好，用约100mL 70