外源化学物质突变作用

1、|遗传毒理学遗传毒理学( (Genetic ToxicologyGenetic Toxicology) )|DNADNA与基因与基因: : 基因基因( (gene)gene) 基因组基因组( (genosomegenosome) ) |染色质染色质( (chromatin)chromatin)与染色体与染色体( (chromosome)chromosome) |体细胞体细胞( (somatic cell)somatic cell)和生殖细胞和生殖细胞( (germ germ cell)cell) |基因型基因型( (genotype)genotype)与表型与表型( (pheotypepheo

2、type) )|细胞周期细胞周期( (cell cycle)cell cycle)、有丝分裂有丝分裂( (mitosis)mitosis)与减数分裂与减数分裂( (meiosis)meiosis) |基因突变（基因突变（gene mutationgene mutation）|染色体畸变（染色体畸变（chromosome aberrationchromosome aberration）|非整倍体和多倍体非整倍体和多倍体 ( (aneuploidyaneuploidy and and polyloidpolyloid) )|二、染色体畸变二、染色体畸变( (chromosome aberratio

3、n)chromosome aberration) 指染色体的结构改变指染色体的结构改变 z染色单体型畸变染色单体型畸变( (chromatidchromatid-type aberration)-type aberration)z染色体型畸变染色体型畸变( (chromosome aberration) chromosome aberration) 染色体畸变染色体畸变裂隙裂隙( (gap)gap) 断裂断裂( (break) break) 断片断片( (fragment)fragment)和和缺失缺失( (deletion)deletion) 微小体微小体( (minute body)min

4、ute body) 无着丝点环无着丝点环环状染色体环状染色体 双着丝点染色体双着丝点染色体 倒位倒位( (inversion)inversion) 易位易位( (translocation)translocation) 插入插入( (insertion)insertion)和和重复重复( (duplication) duplication) 辐射体辐射体 染色体缺失及环状染色体的形成图染色体缺失及环状染色体的形成图 染色体插入和重复示意图染色体插入和重复示意图 染色体的臂间倒位染色体的臂间倒位 染色体相互易位示意图染色体相互易位示意图 |二、染色体畸变二、染色体畸变( (chromosome

5、aberration)chromosome aberration) z1 1非整倍体非整倍体 非整倍体非整倍体( (aneuploidaneuploid) )指细胞丢失或指细胞丢失或增加一条或几条染色体。缺失一条染色体时称为单增加一条或几条染色体。缺失一条染色体时称为单体体( (monosomemonosome) )，增加一条染色体时称为三体增加一条染色体时称为三体( (trisometrisome) )。染色体数目的改变会导致基因平衡的染色体数目的改变会导致基因平衡的失调，可能影响细胞的生存或造成形态及功能上的失调，可能影响细胞的生存或造成形态及功能上的异常。如异常。如2121三体导致先天愚

6、型三体导致先天愚型( (DownDown氏综合征氏综合征) )。z2 2整倍体整倍体 整倍体整倍体( (euploideuploid) )指染色体数目的异常指染色体数目的异常是以染色体组为单位的增减，如形成三倍体是以染色体组为单位的增减，如形成三倍体( (triploid)triploid)、四倍体四倍体( (tetroploidtetroploid) )等。在人体，等。在人体，3 3n n为为6969条染色体，条染色体，4 4n n为为9292条染色体。在肿瘤细胞及人条染色体。在肿瘤细胞及人类自然流产的胎儿细胞中可有三倍体细胞的存在。类自然流产的胎儿细胞中可有三倍体细胞的存在。发生于生殖细胞

7、的整倍体改变，几乎都是致死性的。发生于生殖细胞的整倍体改变，几乎都是致死性的。|一、一、DNADNA损伤与突变损伤与突变|( (一一) )碱基损伤碱基损伤z1. 碱基错配碱基错配z2. 嵌入嵌入DNA链链z3. 碱基类似物的取代碱基类似物的取代z4. 碱基的化学结构改变或破坏碱基的化学结构改变或破坏 |一、一、DNADNA损伤与突变损伤与突变|（二）（二）DNADNA链受损链受损 1. 1. 二聚体的形成二聚体的形成 2. 2. DNADNA加合物（加合物（DNA adductsDNA adducts）形成形成 3. 3. DNA-DNA-蛋白质交联物蛋白质交联物( (DNA-ProteinD

8、NA-Protein crosslinkscrosslinks，DPCDPC) )形成形成 |二、二、引起突变的细胞分裂过程的改变引起突变的细胞分裂过程的改变|三、其他的改变三、其他的改变 对对DNADNA合成和修复有关的酶系统作用可间接导致合成和修复有关的酶系统作用可间接导致 DNADNA损伤，诱发基因突变或染色体畸变。损伤，诱发基因突变或染色体畸变。 |一、一、机体修复机体修复DNADNA损伤的机制可分为两大类：损伤的机制可分为两大类： 1.损伤耐受机制：指损伤耐受机制：指DNA遗传可绕过那些阻止遗传可绕过那些阻止DNA 复制的复制的DNA损伤。损伤。 2. 修复机制：修复机制：DNA修复

9、修复直接修复直接修复切除修复切除修复O6甲基鸟嘌呤修复甲基鸟嘌呤修复光修复光修复错配碱基修复错配碱基修复碱基切除修复碱基切除修复核苷酸切除修复核苷酸切除修复复制后修复复制后修复呼救性修复呼救性修复|二、二、遗传因素对致突变作用的影响：遗传因素对致突变作用的影响： z ( (一一) )代谢酶遗传多态性代谢酶遗传多态性 z ( (二二) )修复功能的个体差异修复功能的个体差异 |一、观察项目的选择一、观察项目的选择z 1 1观察的效应终点类型观察的效应终点类型基因突变和染色体畸变的检测可直接反基因突变和染色体畸变的检测可直接反映化学毒物的致突变性，是评价化学毒映化学毒物的致突变性，是评价化学毒物致

10、突变性唯一可靠的方法。还有许多物致突变性唯一可靠的方法。还有许多试验所观察到的现象并不反映基因突变、试验所观察到的现象并不反映基因突变、染色体畸变和染色体分离异常，而仅反染色体畸变和染色体分离异常，而仅反映致突变过程中发生的其他事件。因此，映致突变过程中发生的其他事件。因此，将试验观察到的现象所反映的各种事件将试验观察到的现象所反映的各种事件统称为统称为遗传学终点遗传学终点( (genetic endpoint)genetic endpoint)。 |一、观察项目的选择一、观察项目的选择z遗传学终点分为遗传学终点分为5 5类：类：DNADNA完整性的改变完整性的改变( (形成加合物，断裂，形成

11、加合物，断裂，交联交联) )；DNADNA重排或交换；重排或交换；DNADNA碱基序列改变；碱基序列改变；染色体完整性改变；染色体完整性改变；染色体分离改变。染色体分离改变。l其中实际上指基因突变，指染色体其中实际上指基因突变，指染色体畸变。畸变。 |2 2成套的观察项目成套的观察项目z遗传毒理学评价程序通常为一组体内、外遗传毒理遗传毒理学评价程序通常为一组体内、外遗传毒理学试验。因为：学试验。因为：化学毒物的种类和结构多种多样，其致突变的机制化学毒物的种类和结构多种多样，其致突变的机制不尽相同，作用的靶细胞也不一样，有的是体细胞，不尽相同，作用的靶细胞也不一样，有的是体细胞，或生殖细胞，或两

12、者兼而有之，故在成套观察项目中或生殖细胞，或两者兼而有之，故在成套观察项目中既要用体细胞检测又要用生殖细胞；除了从分子水平既要用体细胞检测又要用生殖细胞；除了从分子水平还要从细胞水平来检测化学毒物的遗传毒性。还要从细胞水平来检测化学毒物的遗传毒性。致突变物中仅少数具有直接致突变作用，大多数为致突变物中仅少数具有直接致突变作用，大多数为间接致突变作用，即需要在体内代谢活化后，才具有间接致突变作用，即需要在体内代谢活化后，才具有致突变作用。体内试验具有完整的活化系统，而体外致突变作用。体内试验具有完整的活化系统，而体外试验则通过加入模拟代谢系统，如试验则通过加入模拟代谢系统，如S S9 9来弥补缺

13、乏活化来弥补缺乏活化系统的不足。这是体内与体外试验的主要差别。系统的不足。这是体内与体外试验的主要差别。化学毒物的致突变性有强，也有弱；有的在某一检化学毒物的致突变性有强，也有弱；有的在某一检测系统中是强致突变物，而在另一系统中可能是弱的测系统中是强致突变物，而在另一系统中可能是弱的致突变物。对于弱致突变物在某些系统中比较容易漏致突变物。对于弱致突变物在某些系统中比较容易漏检，即出现假阴性。检，即出现假阴性。 |2 2成套的观察项目成套的观察项目|关于遗传毒理学成套观察项目中那些试验可关于遗传毒理学成套观察项目中那些试验可入选的原则有：入选的原则有：z选择的遗传毒性试验应包括选择的遗传毒性试验

14、应包括5 5种类型的遗传种类型的遗传学终点。学终点。z通常的实验材料有病毒、细菌、真菌、培养通常的实验材料有病毒、细菌、真菌、培养的哺乳细胞、植物、昆虫及哺乳动物等。的哺乳细胞、植物、昆虫及哺乳动物等。z体内试验与体外试验配合。体内试验与体外试验配合。z应包括生殖细胞和体细胞。应包括生殖细胞和体细胞。z通常，对于一种受试物应当先用原核细胞或体通常，对于一种受试物应当先用原核细胞或体细胞的体外试验按遗传学终点合理配套进行试细胞的体外试验按遗传学终点合理配套进行试验，并对有阳性结果的遗传学终点验证其在体验，并对有阳性结果的遗传学终点验证其在体内的真实性，再行选用生殖细胞致突变试验进内的真实性，再行

15、选用生殖细胞致突变试验进行遗传危害的评价。行遗传危害的评价。 |二、常用的致突变试验二、常用的致突变试验 z( (一一) )细菌回复突变试验细菌回复突变试验( (AmesAmes试验试验) ) 鼠伤寒沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌原养型原养型(his+)组氨酸营养缺陷型突组氨酸营养缺陷型突变株。变株。(his-)正向突变正向突变回复突变回复突变代谢活化系统代谢活化系统受试物受试物|二、常用的致突变试验二、常用的致突变试验z( (二二) )微核试验微核试验 微核微核( (Micronucleus)Micronucleus)的产生与染色体损伤有关，的产生与染色体损伤有关，是染色体或染色单体的无着丝点断片或

16、纺锤丝是染色体或染色单体的无着丝点断片或纺锤丝受损伤而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期受损伤而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期遗留在细胞质中，末期之后，单独形成一个或遗留在细胞质中，末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，包含在子细胞的胞质内，因几个规则的次核，包含在子细胞的胞质内，因比主核小，故称微核。比主核小，故称微核。在细胞质中微核来源有在细胞质中微核来源有二：断片或无着丝粒染色体在细胞分裂后期不二：断片或无着丝粒染色体在细胞分裂后期不能定向移动，而遗留在细胞质中；有丝分裂毒能定向移动，而遗留在细胞质中；有丝分裂毒物的作用使个别染色体或带苔丝粒的染色体环物的作用使个别染色体或带苔丝粒的染

17、色体环和断片在细胞分裂后期被留在细胞质中。和断片在细胞分裂后期被留在细胞质中。微核微核试验试验( (Micronucleus Micronucleus testtest，MNTMNT) )是观察受试物是观察受试物能否产生微核的试验。能否产生微核的试验。其主要可检出其主要可检出DNADNA断裂断裂剂和非整倍体诱变剂。剂和非整倍体诱变剂。 (二二)微核试验微核试验MNNCE|二、常用的致突变试验二、常用的致突变试验z(三三)染色体畸变分析染色体畸变分析 z(四四)姐妹染色单体交换试验（姐妹染色单体交换试验（SCE） |二、常用的致突变试验二、常用的致突变试验z(五五)果蝇伴性隐性致死试验果蝇伴性隐

18、性致死试验z(六六)显性致死试验显性致死试验z(七七)程序外程序外DNA台成试验台成试验 z(八八)转基因动物致突变试验转基因动物致突变试验z(九九)哺乳动物细胞基因突变试验哺乳动物细胞基因突变试验|三、致突变试验中的一些问题三、致突变试验中的一些问题 z(一一)阴性和阳性对照的设立阴性和阳性对照的设立 1 1阴性对照阴性对照 它是空白对照，即不加任何处理。它是空白对照，即不加任何处理。或者是溶剂对照。阴性对照除了无处理因素外，或者是溶剂对照。阴性对照除了无处理因素外，与实验组完全相同。其目的是获得实验的基础与实验组完全相同。其目的是获得实验的基础数据。例如，数据。例如，AmesAmes试验的

19、阴性对照可了解所用试验的阴性对照可了解所用的细菌的自发回复突变率；证实除处理因素外的细菌的自发回复突变率；证实除处理因素外无任何使回复突变率增加或减少的因素。无任何使回复突变率增加或减少的因素。 2 2阳性对照阳性对照 是用某种已知能产生阳性反应是用某种已知能产生阳性反应的物质作为对照。其目的是通过对阳性物质的的物质作为对照。其目的是通过对阳性物质的试验证明实验方法的可靠；验证实验者在本实试验证明实验方法的可靠；验证实验者在本实验条件下，完成技术和鉴定致突变物的能力；验条件下，完成技术和鉴定致突变物的能力；证实经一段时间后，本实验的重复性。例如，证实经一段时间后，本实验的重复性。例如，Ames

20、Ames试验中阳性对照未出现阳性结果，应考虑试验中阳性对照未出现阳性结果，应考虑突变菌株可能发生问题，另一种可能是代谢活突变菌株可能发生问题，另一种可能是代谢活化能力不足。所以，当阳性对照结果未呈阳性，化能力不足。所以，当阳性对照结果未呈阳性，其实验组的实验数据可靠性亦大大降低。其实验组的实验数据可靠性亦大大降低。 |三、致突变试验中的一些问题三、致突变试验中的一些问题z(二二)体外试验的活化系统体外试验的活化系统 1 1哺乳动物细胞介导哺乳动物细胞介导 使用完整的细胞，特别是使用完整的细胞，特别是大鼠肝原代细胞，与测试细菌或细胞一起培养。这大鼠肝原代细胞，与测试细菌或细胞一起培养。这也是一种

21、活化系统。它有完整的细胞结构和各种酶也是一种活化系统。它有完整的细胞结构和各种酶及内源性辅助因子，代谢能力优于无细胞系统如及内源性辅助因子，代谢能力优于无细胞系统如S9S9，但不如体内活化系统。但不如体内活化系统。 2 2S9 S9S9 S9指经酶诱导剂处理后制备的肝匀浆，再指经酶诱导剂处理后制备的肝匀浆，再经经90009000g g离心分离所得上清液，加上适当的缓冲液离心分离所得上清液，加上适当的缓冲液和辅助因子。它主要含有混合功能氧化酶和辅助因子。它主要含有混合功能氧化酶( (MFO)MFO)，是国内常规应用于体外致突变试验的代谢活化系统，是国内常规应用于体外致突变试验的代谢活化系统，其缺

22、点是其缺点是S9S9随实验动物种属或器官不同而有差异；随实验动物种属或器官不同而有差异；S9S9含有的大量亲核物质有可能影响试验的敏感性。含有的大量亲核物质有可能影响试验的敏感性。 3 3纯化酶和基因工程纯化酶和基因工程 应用纯化细胞色素应用纯化细胞色素P-450P-450、谷胱苷肽转移酶及过氧化物水解酶，可严格控制代谷胱苷肽转移酶及过氧化物水解酶，可严格控制代谢产物诱发突变的条件，但技术难度大。利用基因谢产物诱发突变的条件，但技术难度大。利用基因工程，将人的细胞色素工程，将人的细胞色素P-450P-450基因，插入组合细胞基因，插入组合细胞内，用上述细胞进行致突变试验，使细胞具有代谢内，用上

23、述细胞进行致突变试验，使细胞具有代谢活化系统。活化系统。 |三、致突变试验中的一些问题三、致突变试验中的一些问题z(三三)致突变试验与致癌试验的关系致突变试验与致癌试验的关系 已知大多数化学致癌物具有致突变作用，遗已知大多数化学致癌物具有致突变作用，遗传学改变在原癌基因激活和抑癌基因失活上起传学改变在原癌基因激活和抑癌基因失活上起主要作用，致癌物诱致关键靶基因遗传改变的主要作用，致癌物诱致关键靶基因遗传改变的直接作用等在哺乳动物实验中证实。直接作用等在哺乳动物实验中证实。发现人类接触致癌物与发现人类接触致癌物与DNADNA加合物，同其肿瘤加合物，同其肿瘤中癌基因和抑癌基因的特异碱基对突变之间具

24、中癌基因和抑癌基因的特异碱基对突变之间具有相关性。有相关性。传统的长期致癌试验，花费大，周期长，不传统的长期致癌试验，花费大，周期长，不能适应化学物质快速增长的需要。此外，致癌能适应化学物质快速增长的需要。此外，致癌试验所用动物数量有限，难以检出弱的致癌物。试验所用动物数量有限，难以检出弱的致癌物。需要发展多种体内和体外短期试验，用于对化需要发展多种体内和体外短期试验，用于对化学物质致癌性进行筛检。学物质致癌性进行筛检。 |三、致突变试验中的一些问题三、致突变试验中的一些问题z(四四)试验结果在毒理学安全性评价中的作用试验结果在毒理学安全性评价中的作用 阴性结果判定条件：阴性结果判定条件：最高

25、剂量应包括受试物溶解度许可或灌胃量最高剂量应包括受试物溶解度许可或灌胃量许可的最大剂量。如该剂量毒性很大，则体内许可的最大剂量。如该剂量毒性很大，则体内试验和细菌试验应为最大耐受量。使用哺乳动试验和细菌试验应为最大耐受量。使用哺乳动物细胞进行体外试验，常选物细胞进行体外试验，常选LDLD5050或或LDLD8080为最大剂为最大剂量。溶解度大、毒性低的化学物，在细菌试验量。溶解度大、毒性低的化学物，在细菌试验中可以中可以50005000gg皿作为最高剂量。皿作为最高剂量。各剂量组的组间差距不应过大，以防漏检仅各剂量组的组间差距不应过大，以防漏检仅在非常狭窄范围内才有突变能力的某些化学毒在非常狭

26、窄范围内才有突变能力的某些化学毒物。满足上述条件，仍为阴性，才慎重下结论。物。满足上述条件，仍为阴性，才慎重下结论。 |三、致突变试验中的一些问题三、致突变试验中的一些问题z(四四)试验结果在毒理学安全性评价中试验结果在毒理学安全性评价中的作用的作用阳性结果应具有剂量阳性结果应具有剂量反应关系，即随反应关系，即随剂量增加，致突变作用增加；和在一组剂量增加，致突变作用增加；和在一组或多组的观察值与阴性对照比较有显著或多组的观察值与阴性对照比较有显著性差异。阳性结论，即表明受试物具有性差异。阳性结论，即表明受试物具有致突变性，而不同致突变试验的遗传学致突变性，而不同致突变试验的遗传学终点不同，其所

27、表示的含义不一。如基终点不同，其所表示的含义不一。如基因突变是具有导致遗传性疾病的突变，因突变是具有导致遗传性疾病的突变，DNADNA修复的实际后果尚不明确。修复的实际后果尚不明确。 |美国美国EPA毒物处毒物处(1936)提出了一个三阶段的试验方案，把遗提出了一个三阶段的试验方案，把遗传毒性检测和生殖细胞致突变性验证分阶段进行。传毒性检测和生殖细胞致突变性验证分阶段进行。z第一阶段测试化学物的遗传毒性，包括第一阶段测试化学物的遗传毒性，包括Ames试验、体外哺乳动试验、体外哺乳动物细胞基因突变试验、体内骨髓染色体损伤试验物细胞基因突变试验、体内骨髓染色体损伤试验(微核试验或染微核试验或染色体

28、畸变试验色体畸变试验)；z第二阶段测试对生殖细胞的致突变作用；第二阶段测试对生殖细胞的致突变作用；z第三阶段为哺乳动物生殖细胞致突变性标准试验。第三阶段为哺乳动物生殖细胞致突变性标准试验。z在遗传危害性评价时，在体外基因突变试验中呈阳性的化学物在遗传危害性评价时，在体外基因突变试验中呈阳性的化学物应进行与哺乳类性腺应进行与哺乳类性腺DNA相互作用的试验，包括睾丸细胞的相互作用的试验，包括睾丸细胞的SCE、UDS、染色体畸变及碱性洗脱试验等，也可进行显性致染色体畸变及碱性洗脱试验等，也可进行显性致死试验，在第二阶段中出现阳性反应，需进行小鼠特异座位试死试验，在第二阶段中出现阳性反应，需进行小鼠特

29、异座位试验，可观察形态改变或生化改变；在体内骨髓细胞染色体畸变验，可观察形态改变或生化改变；在体内骨髓细胞染色体畸变试验或微核试验中呈阳性的化学物需进行显性致死试验，在第试验或微核试验中呈阳性的化学物需进行显性致死试验，在第二阶段中出现阳性反应，再进行小鼠可遗传易位试验。二阶段中出现阳性反应，再进行小鼠可遗传易位试验。 |国际协调组织国际协调组织(1CH)(1997)对于药品的遗传毒性评价建对于药品的遗传毒性评价建议的检测试验组合为议的检测试验组合为z细菌基因突变试验；细菌基因突变试验；z体外哺乳动物细胞染色体畸变试验或体外小鼠淋巴瘤体外哺乳动物细胞染色体畸变试验或体外小鼠淋巴瘤细胞比试验；细

30、胞比试验；z体内啮齿类造血细胞染色体损伤试验体内啮齿类造血细胞染色体损伤试验(骨髓细胞染色体骨髓细胞染色体畸变试验或骨髓或外周血多染红细胞微核试验畸变试验或骨髓或外周血多染红细胞微核试验)。z在对经标准试验组合得到的致突变作用结果进行进一步在对经标准试验组合得到的致突变作用结果进行进一步研究时，其他试验如研究时，其他试验如DNA加合物测定、加合物测定、DNA链断裂检测、链断裂检测、DNA修复和重组试验等都可作为供选择的试验。对于在修复和重组试验等都可作为供选择的试验。对于在三项标准试验中为阴性的化学物，通常可认为其无遗传三项标准试验中为阴性的化学物，通常可认为其无遗传毒性作用。但对于构效关系显示有可能具致癌性或致突毒性作用。但对于构效关系显示有可能具致癌性或致突变性，但在三项标准试验中为阴性的化学物，还需要改变性，但在三项标准试验中为阴性的化学物，还需要改进试验方法或再增加试验项目。对于