病毒膜蛋白及其表达和纯化技术的研究进展_cropped

1、海 洋 湖 沼 通 报Transactions of Oceanology and Limnology2002 年4文章编号：10036482（2002）04007607病毒膜蛋白及其表达和纯化技术的研究进展*解飞霞 1宋晓玲 2倢 2黄(1 青岛海洋大学， 266003)(2 中国水产研究院黄海水产研究所，青岛 266071)摘 要：病毒囊膜是包膜病毒除核衣壳外的另一主要成分。它主要由多种蛋白质构成，称为膜蛋白。膜蛋白以单聚体、二聚体、三聚体，甚至更多的聚合体的形 式存在，具有中和抗体、与靶细胞受体结合、凝集红细胞、诱导细胞融合等多种功 能。膜蛋白可采用将其基因整合入载体，并在昆虫细胞、哺乳

2、细胞或细菌中获得体 外表达。膜蛋白可在去污剂的作用下形成蛋白质-脂-去污剂的复合物而被溶解，其 中去污剂的临界微团浓度、亲水物-亲脂物平衡值、荷电、紫外穿透性等是选择合适 去污剂的主要参考因子。溶解后的膜蛋白多利用聚丙烯酰胺凝胶电泳、凝胶过滤层 析、离子交换层析、亲和层析、高效液相层析等技术并结合梯度离心、分级沉淀等 进行分离、纯化。关键词：病毒膜蛋白，结构，功能，表达，纯化中图分类号：文献标识码：A病毒是由一个或几个 RNA 或 DNA 分子组成的传染因子。通常有一种或几种蛋白构成的衣壳包围。比较复杂的病毒在核衣壳外面还有一层或几层富含脂质的外膜，即囊膜。例如, 单 纯疱疹病毒 HSV、冠性

3、病毒 coronavirus、腺病毒 adenovirus、虫媒病毒 alphavirus、黄病毒flavivirus、风疹病毒 rubellavirus、昆虫病毒 pestivirus 等等。包膜的成分主要来自其宿主细 胞，由蛋白质、脂质、多糖类等组成。蛋白质是病毒粒子除核酸以外的又一主要成分。膜蛋白大多是由核衣壳在感染细胞内穿越核膜得到的或在感染细胞表面“出芽”时由细胞获得， 但囊膜也含有特异的病毒蛋白单位。中和抗体、与靶细胞结合、红细胞凝集等是病毒膜蛋白的主要功能。纯化膜蛋白并对其进行研究，对研究病毒感染的分子机理，进一步对阻断病毒 与靶细胞结合及生产新型疫苗有着重要的意义。1病毒膜蛋白

4、的结构与功能1 . 1 病毒膜蛋白的结构病毒完成装配后，从细胞中释放出来。细胞膜双层磷脂中原有的细胞源性蛋白被病毒第一作者简介：解飞霞，女，1976 年生。青岛海洋大学生命学院海洋生物系硕士研究生。收稿日期：2001-12-30.徐怀恕 1蛋白完全地或部分地取代，成为病毒的膜蛋白。膜蛋白含有两段由疏水性氨基酸组成的电中性区域。一段在蛋白的 N 段，称信号肽，另一段在近 C 端，称膜嵌段。其中信号肽有将膜蛋 白引导和转移入细胞膜的作用。膜嵌段因疏水而停留在膜内。有的膜蛋白与细胞源性糖分子 结合成糖蛋白。糖蛋白除其一小部分 C 端位于膜的内侧绝大部分被挤至细胞外。膜的结构可应用电镜和 X 射线观察

5、(Caspar et al, 1962; Horrison et al, 1983; Harrison et al,1978; Rossman et al, 1985)。但病毒膜蛋白在制备时不易结晶易被破坏，而且结构多变，可利 用电子显微镜观察不固定和不染色的病毒的膜的结构（Vogel，et al, 1986）。免疫荧光技术证 实外膜蛋白是点状或颗粒状的。根据膜蛋白在膜上定位的不同，膜蛋白分为外膜蛋白和整合膜蛋白。外膜蛋白分布于膜 的脂双层表面。整合膜蛋白又分为两大类，一类全部埋在脂双层中；另一类仅疏水区在脂双 层中，而亲水区在膜的内外两侧。膜蛋白一般是以单聚体、二聚体、三聚体甚至更多的聚合

6、体的形式存在。1.1.1 单聚体和二聚体TBE(蜱热脑炎)病毒的膜蛋白是由单聚体和一个对称的二聚体构成。单聚体分为三个区，大部分是片层结构，也有少量的螺旋，三个区之间由二硫键桥接。二聚体的亚单位延伸为断裂的桶状结构，它的轴与病毒表面垂直，它的 C 端象 IGC 一样折叠，由 15 个残基靠 二硫键与单聚体相连（Rey，et al, 1990）。Flavivirus(黄病毒)的膜蛋白也由单聚体和二聚体构 成。单聚体由 500 个氨基酸残基构成，C 端有两个跨膜区，其外膜蛋白为二聚体，并在酸性 条件下（pH6.5）成为三聚体（Chambers, et al, 1990）。1.1.2 二聚体Alph

7、avirus(虫媒病毒)的膜蛋白是 80 个糖蛋白棘突。每个棘突由三个杂二聚体组成。杂二聚体由 E1（49Kd）和 E2（51Kd）构成（Vogel,et al,1986；Paredes,et al,1993；Cheng,et al,1995；Fuller, et al, 1995；Paredes, et al, 1998），E1 有一个酰化位点，E2 有四个以上酰化位点，因而得出它们由外膜区、跨膜区和内膜区构成（Garoff,et al,1980）。有人认为 MHV(鼠脑炎病毒)外膜蛋白是酰基化的（Yu et al,1994），但未成功应用棕榈酸标记加以证实（Godet et al, 199

8、2）。1.1.3 三聚体流感病毒的膜蛋白是三聚体，分为外膜区和跨膜区，在酶的作用下会成为由 P62 和 E1 组成的杂二聚体，它是 P62 和 E1 的翻译产物；E1 可转变成由二硫键连接的聚合体，与 P62 聚合后自身不再聚集。1.2 病毒膜蛋白的功能由于病毒膜蛋白在结构上有一定的共性，因而不同病毒膜蛋白的功能基本相似(见表 1)。除以上功能外，膜蛋白还可导致病毒的形态变化。Fisher 曾用密集氨基酸加电诱变和目标DNA 重组技术，证实了膜蛋白在病毒颗粒的形态变化中起的作用。海洋湖沼通报2002 年78表 1Table 1病 毒 膜 蛋 白 的 主 要Main functions of v

9、iral envelope功能病毒膜蛋白的体外表达2蛋白质的表达是为了获取大量的目标蛋白的而进行的有目的性的蛋白质的合成。将编码所需产物的基因插入到运用 DNA 重组技术构建的质粒或其他载体中，载体导入活细胞，表 达完成后对表达产物进行结构及生化特性的研究。为了进行膜蛋白的研究，必须获得纯的膜 蛋白。由于病毒的膜蛋白含量很少难于纯化。采用蛋白质表达技术获得大量的目的膜蛋白通 过体外表达获得一定量的膜蛋白，是研究病毒膜蛋白的必要前提工作。表达的方法为把目的膜蛋白的基因整合入载体而后在细胞中表达。膜蛋白的基因通过 DNA 测序获得，载体须包含指导大量合成与所插入基因相应的 mRNA 启动子，允许期

10、在宿 主体内自主复制的序列、编码的遗传性状以及辅助筛选含载体的细胞的序列和能增强 mRNA 翻译效率的序列，一般采用另一种病毒或者细菌的质粒。而表达多是在昆虫细胞、哺乳动物 细胞或细菌中进行。SFV(semliki 森林病毒)的表达是通过质粒 DNA 转录出 RNA，去转染 BHK-21 细胞获得的（Andersson，et al, 1997）。HSV(单纯疱疹病毒)外膜糖蛋白的表达是用包 含糖蛋白基因的重组杆状病毒感染 Sf21 细胞得到的（Welling-Wester，et al, 1998）。HTLV-I (人 体 T 细胞白血病病毒 I-型)的外膜糖蛋白的表达是把包涵编码外膜蛋白基因片

11、段的质粒插入到 载体再诱导到细菌中获得的。表达过程中标记技术的应用，有利于对表达产物进行定量或定性的分析。Raamsan，(1999) 对目的蛋白进行放射性标记，即细胞用 35S 在体内进行标记而后进行脉冲跟踪试验，裂解细 胞，释放产物进行免疫沉淀和免疫分离，用 SDS-PAGE 分析后进行放射性定量。Tallet(2000）病 毒膜 蛋 白功 能单纯疱疹病毒 (HSV-1)(1) 糖膜蛋白 gB、gD、gH 和 gL(2) 糖膜蛋白 gD(3) 糖膜蛋白 gC 或 gB诱导细胞融合与受体接合 调节病毒与细胞表面的结合泡状口炎病毒 (VSV)外膜糖蛋白 G中和抗体、保护性免疫反应鼠肝炎病毒 (

12、MHV)(1) 外膜蛋白 Epr可导致病毒形态变化与宿主结合并侵入靶细胞(2) 膜蛋白 M与病毒装配有关传染性肝炎坏死病病毒 (IHNV)外膜糖蛋白 G中和抗体和保护性免疫反应人体 T 细胞白血病病毒(HTLV-I)(1) 糖膜蛋白 C 端与细胞受体接合并侵入靶细胞免疫和中和作用(2) 跨膜糖蛋白红细胞凝集作用semliki 森林病毒 (SFV)糖膜蛋白 E1、E2红细胞凝集作用与细胞受体接合马立克氏病病毒 (MDV)糖膜蛋白 B中和抗体作用蜱热脑炎病毒 (TBE)(1) 外膜糖蛋白 E调节与细胞受体地结合诱导细胞融合 诱导保护性免疫反应(2) 跨膜蛋白 E红细胞凝集作用对表达产物用 SDS-

13、PAGE 分开内-外胞质部分，通过 Western 印记分析，用 MF2 单克隆抗体来鉴定外膜蛋白，其中膜蛋白的 C 端有组氨酸标记物以利于纯化的进行。病毒膜蛋白的纯化3病毒膜蛋白的分离纯化是研究膜蛋白的基础和起点。大多数膜蛋白是和膜整合在一起的，因而提纯较为困难，需用去污剂把膜增溶下来。去污剂是提取和纯化膜蛋白的关键性试剂（Neugebauer，1990），用去污剂溶解膜包括蛋白或目标性提取物是纯化膜蛋白的第一步。3.1 去污剂的选择合成或天然存在的表面活性具有去污作用的物质称为去污剂。它是类脂类物质，与膜的 主要成分类似，它包含一个亲水的头和一个疏水的尾。它们在脂双层中可以和脂类竞争，并

14、比他们更具有亲水性。膜蛋白以去污剂-蛋白质的复合物形式溶解在水中，类似脂类分子，去 污剂在膜蛋白的纯化中可以帮助维持膜蛋白的天然构象。去污剂可分为几类（Helenius，et al, 1995；Tanford，et al，1976；Helenius，et al, 1979；Hjelmeland，et al, 1984；Goneme，et al, 1978；Plusquellet，et al, 1989；Ede，et al, 1989；Brenner，et al, 1995），主要有：(a)离子型去污剂，如SDS、脱氧胆酸钠；(b)温和性非离子去污剂，如Triton X-100、Np-40；(c

15、)温和性两性去污剂, 如DDMAU、DDMAB。在膜的提取中，去污剂的选择很关键。临界微团浓度、亲水物-亲脂物平衡值、荷电、紫外穿透性等是选择去污剂的主要参考因子。3.1.1 临界微团浓度 (CMC，critical micelle concentration)CMC 低的去污剂容易用透析除去，但不容易溶解蛋白；CMC 高的去污剂容易使蛋白变 性。同一 CMC 的不同去污剂对膜蛋白增容能力也不一样。Welling-Wester 等(1998)用 CMC 不同的去污剂纯化 HSV-1(单纯疱疹病毒 1 型)糖膜蛋白，得到的量有显著的不同。3.1.2 亲水物亲脂物平衡值 (HLB, hydroph

16、ile-lipophile balance number)同一去污剂而 HLB 值不同，在膜提取中的作用也不一样。HLB 值在 12-15 可以溶解膜，HLB 值为 15 的可以溶解脂和生物膜。HLB 在 15-20 的可以溶解外膜蛋白，超出上述范围的只能用作润湿剂和渗透剂。HLB 值也与膜蛋白的获得量有关，J.Van 等(1989)曾证明 HLB 值 在 12.5 左右的去污剂对膜蛋白的增溶效果最好。3.1.3 其他去污剂的选择还与其它的因素有关，如：荷电、紫外穿透性、对蛋白活性的影响等。一 般来说，用 280nm 检测蛋白的不能用 Triton X-100 等有紫外吸收的去污剂；用离子交换

17、或电 泳分析的不能用带荷电的去污剂；对蛋白活性的影响来说，离子型去污剂比温和性两性去污剂和温和性非离子去污剂的影响要大。在使用去污剂纯化膜蛋白前，应用多种去污剂筛选它们溶解蛋白并保持蛋白活性的能力（Hjelmeland 和 Chrambuch, 1998）。Wangler 等（1999）采用 NP-40 和超速蔗糖梯度离心提 取了细胞表达的 Alphavirus(虫媒病毒)的外膜蛋白并获得了结晶；Kelly 等（1974）、Mcallister 和 Wagner（1975）用非离子性去污剂 TritonX-100 和超速离心分别从 VSV(泡状口炎病毒)、 IHNV(传染性肝炎坏死病病毒)中提

18、取了外膜糖蛋白。海洋湖沼通报2002 年803.2 病毒膜蛋白纯化技术膜在去污剂的作用下可变成蛋白质脂去污剂的复合物而被溶解。膜被溶解后，可连 续进行膜蛋白的纯化。纯化的方法主要有电泳、常规层析技术，如：凝胶过滤层析、离子交 换层析、亲和层析以及高效液相层析等。3.2.1 凝胶过滤层析凝胶过滤层析亦称分子筛或体积排阻层析。其基本原理是根据多孔的载体对不同体积、 不同形状的分子具有不同的排阻能力，从而将蛋白质混合物分离。由于样品在洗脱过程中会 被不断的稀释，因而凝胶过滤层析一般用于膜蛋白最后阶段的分离。Kelly 等（2000）用离子 性去污剂 SDS、凝胶过滤和 HPLC 纯化了 Dengue

19、2(登革热 2)病毒的外膜糖蛋白，Engeking 等（1989）用离子性去污剂 SDS 和凝胶过滤获得了 IHNV(传染性肝炎坏死病病毒)的糖膜蛋白。3.2.2 离子交换层析离子交换层析以纤维素或交联葡聚糖凝胶等物质的衍生物为载体。在某一 pH 值条件下， 这些载体带有正电荷或负电荷，而当待分离蛋白质分子通过载体时，通过离子交换作用，使 蛋白质分子达到分离纯化的目的。由于蛋白质是两性电解质，离子交换层析是目前分离纯化蛋白质常用的方法之一。刘强等(1998)用 DEAE-sepharose 结合凝胶过滤获得了粘虫颗粒病毒的增效因子(外膜蛋白)。3.2.3 亲和层析亲和层析是一种以样品的生物活性

20、为依据的分离、分析膜蛋白方法，是利用蛋白具有能 和某些相对应的专一分子可逆结合的特性而发展起来的层析技术。当蛋白质溶液通过层析柱时，其中可与亲和载体配基相互作用的受体被吸附剂结合，而不被吸附的无关成分则可随流出液通过柱体，从而将吸附蛋白与其他蛋白质分开；而后利用高浓度的底物溶液或亲和力更 强的底物衍生溶液洗脱，目标蛋白即可脱离层析柱上的载体。Tallet 等（2000）用两步亲和层 析与高浓度的盐和非离子去污剂获得了 HTLV-I(人体 T 细胞白血病病毒)的膜蛋白。3.2.4 高效液相色谱（HPLC） 高效液相层析的分离原理和操作方法与经典的液相色谱（如离子交换、凝胶过滤等）相同，由于它具有

21、高压洗脱的特点，因此，分离、分析效率极高，除此之外，高压液相层析还可应用于使用保留时间鉴定化合物、样品的纯度鉴定、分子量鉴定及多肽的肽谱分析等。目 前，高效液相层析已从经典的 HPLC 柱发展到微柱、无孔径载体以及毛细管 HPLC 柱，使 HPLC 的灵敏度大大提高。它的分析速度快、灵敏度高、分辨率好、分离化合物范围广、样 品量少、体积小，并可以从洗脱液中回收具有全部生物活性的样品。Welling-Wester（1998） 用 HPIEC(高效离子交换层析)和两性去污剂 DDMAU 和 DDMAB 得到了 HSV(单纯疱疹病毒) 的膜糖蛋白。3.2.5 电泳技术电泳技术作为分离纯化蛋白质的手段

22、之一，无论是单向凝胶电泳还是双向凝胶电泳都是分离度 极高的分离方法。电泳可分为变性电泳、常规电泳、等电聚焦电泳和毛细管电泳。获得分离的蛋白质均可用电洗脱或电转印到硝酸纤维素膜上直接进行序列分析。Schleicher 和 Schnell用 SDS-PAGE 和电洗脱获得了纯化的糖膜蛋白；Engelking 等（1989）用 SDS-PAGE 和电洗脱获得了 IHNV(传染性坏死病病毒)的外膜蛋白。 进行膜蛋白的纯化，一般要用两种以上的层析方法，才能获得电泳纯的成分。若样品含蛋白种类较多，需要用其他方法去除一些非目的蛋白，如，梯度离心、分级沉淀等，这样才 能有利于后面的纯化步骤。结束语4由于病毒的

23、膜蛋白具有多种重要功能，因而病毒膜蛋白的研究渐成热点。找到病毒膜蛋白与受体靶细胞的结合位点，了解二者结合的机制，并找到阻断它们与受体的结合方法，从 而治疗由病毒引起的病害是当今研究工作的重点。相信随着现代科学技术及生物工程的高速 发展，病毒膜蛋白研究工作将取得更重要的突破。参考文献:1 J.萨姆布鲁克 E.F.弗里奇 T.曼尼阿蒂斯著。 «分子克隆实验指南»。M 1995. 北京：科 学出版社。2 吕宝璋 卢 建 安明榜。受体学。 M 2000. 合肥：安徽科学技术出版社。3 殷 震 刘景华主编。 动物病毒学。M（第二版）。 1997. 北京：科学出版社。 4 D.R. 马

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