原粮霉菌毒素检测手册

1、.原 粮 霉 菌 毒 素 检 测实用操作手册江苏省微生物研究所有限公司编制二六年四月·无锡一、 样品的采集、制备及保存1、 样品的采集： 样品的概念：按照规定的方法及使用适当的工具，采取一定数量的具有代表整体质量的部分，以供分析检验用，该部分叫做样品。 采样的过程：检样 原始样品 平均样品 试验样品（试样）。 采样的类型：选择性采样；客观性采样。 采集后的处理：附上标签，注明名称、日期、数量、采样地点及方法，签封并登记。2、 样品的制备：原始样品的分取、粉碎、混匀、缩分的过程。注意防止成份的变化及交叉污染。常用的制备方法： 机械混匀法（四分法、分样器法）； 粉碎、过筛法； 研磨法；

2、搅拌法。3、 样品的保存： 当天采集的样品原则上当天测。 使用的容器应用2的次氯酸钠水溶液浸泡后，再洗干净晾干或烘干备用。 一般样品检验结束后保留样品1个月，以备复查。二、 待测液的制备1、 黄曲霉毒素B1待测液的制备：称量：准确称取5.0g均匀的粉碎样品；提取：用甲醇水（1:1）溶液25ml来振荡提取半小时，过滤；稀释：取滤液1ml，用甲醇水（1:1）进行稀释，记好稀释倍数； 储藏：稀释好的待测液直接进行检测或具塞小试管封存，放置冰箱中，避光保存，隔天检测（冰箱中放置最好不超过两天）。2、 呕吐毒素（DON）待测液的制备：称量：准确称取5.0g均匀的粉碎样品；提取：用甲醇水（1:9）溶液25

3、ml来振荡提取半小时，过滤；稀释：取滤液1ml，用甲醇水（1:9）进行稀释，记好稀释倍数； 储藏：稀释好的待测液直接进行检测或具塞小试管封存，放置冰箱中，避光保存，隔天检测（冰箱中放置最好不超过两天）。3、 玉米赤霉烯酮（ZEN）待测液的制备：称量：准确称取5.0g均匀的粉碎样品；提取：用甲醇水（7:3）溶液20ml来振荡提取半小时，过滤；稀释：取滤液1ml，用甲醇水（7:3）进行稀释，记好稀释倍数； 储藏：稀释好的待测液直接进行检测或具塞小试管封存，放置冰箱中，避光保存，隔天检测（冰箱中放置最好不超过两天）。三、 大量样品的集中初筛：1、黄曲霉毒素B1定性测定法。注意点：稀释：取滤液1ml，

4、用甲醇水（1:1）进行稀释，记好稀释倍数；依据国家对小麦（玉米、花生）中限量标准来进行适当稀释。比如：玉米中国家标准最大允许量为20ug/kg，那么滤液应稀释4倍。（允许量除以5）试剂的配制：酶标抗原，洗涤液。实验设计：截取相当数量的反应孔；设定三个对照孔（仪器调零孔，阴性对照孔，阳性对照孔（1.0ng/ml）；其余为样品孔（一般一次性测21个样品，以防操作时间过长带来的误差）。显色后先目测，比较样品孔和阳性孔的颜色，若阳性孔的颜色深于样品孔，则样品孔的浓度大于1.0，样品超标。加终止液，酶标仪测出吸光度，作为原始记录。2、呕吐毒素（DON）定性测定法。注意点： 稀释：取滤液1ml，用甲醇水（

5、1:9）进行稀释，记好稀释倍数；依据国家对小麦（玉米、大麦）中限量标准来进行适当稀释。比如：国家标准最大允许量为1000ug/kg，那么滤液应稀释2倍，与浓度为100ng/ml的标准点进行比较。 试剂的配制：酶标二抗，洗涤液，DON单克隆抗体。 实验设计：截取相当数量的反应孔；设定2个对照孔（阴性对照孔（0ng/ml），阳性对照孔（100ng/ml）；其余为样品孔（一般一次性测21个样品，以防操作时间过长带来的误差）。 洗涤：该实验中有两次洗涤，请严格按洗涤程序进行。 显色后先目测，比较样品孔和阳性孔的颜色，若阳性孔的颜色深于样品孔，则样品孔的浓度大于100，样品超标。 加终止液，酶标仪测出吸

6、光度，作为原始记录。3、玉米赤霉烯酮（ZEN）定性测定法。注意点： 稀释：取滤液1ml，用甲醇水（7:3）进行稀释，记好稀释倍数；依据国家对小麦、玉米中限量标准来进行适当稀释。比如：国家标准最大允许量为60ug/kg，那么滤液应稀释3倍，与浓度为5ng/ml的标准点进行比较。 试剂的配制：酶标二抗，洗涤液，DON单克隆抗体。 实验设计：截取相当数量的反应孔；设定2个对照孔（阴性对照孔（0ng/ml），阳性对照孔（5ng/ml）；其余为样品孔（一般一次性测21个样品，以防操作时间过长带来的误差）。 洗涤：该实验中有两次洗涤，请严格按洗涤程序进行。 显色后先目测，比较样品孔和阳性孔的颜色，若阳性孔

7、的颜色深于样品孔，则样品孔的浓度大于5，样品超标。加终止液，酶标仪测出吸光度，作为原始记录。四、 阳性样品的定量检测：1、黄曲霉毒素B1定量测定法，样品主要为超标样品，通常重新提取样品并制备待测液。注意点：稀释：取滤液1ml，用甲醇水（1:1）进行稀释，依据国家对小麦（玉米、花生）中限量标准来进行适当稀释。比如：玉米中国家标准最大允许量为20ug/kg，那么滤液本应稀释4倍（允许量除以5）。但是因超标，所以加大稀释倍数，一般将上述稀释液再进行稀释25倍即可。试剂的配制：酶标抗原，洗涤液。实验设计：截取相当数量的反应孔；设定标准曲线孔（0、0.1、0.5、1.0、5.0ng/ml）；其余为样品孔

8、。酶标仪测出吸光度，作为原始记录。 软件计算。2、呕吐毒素(DON)定量测定法，样品主要为超标样品，通常重新提取样品并制备待测液。注意点：稀释：取滤液1ml，用甲醇水（1:9）进行稀释，依据国家对小麦（玉米、大麦）中限量标准来进行适当稀释。比如：国家标准最大允许量为1000ug/kg，那么滤液本应稀释2倍。但是因超标，所以加大稀释倍数，一般将上述稀释液再进行稀释24倍即可。试剂的配制：酶标二抗，洗涤液，DON单克隆抗体。实验设计：截取相当数量的反应孔；设定标准曲线孔（0、10、100、500、1000ng/ml）；其余为样品孔。酶标仪测出吸光度，作为原始记录。软件计算。3、玉米赤霉烯酮(ZEN

9、)定量测定法，样品主要为超标样品，通常重新提取样品并制备待测液。注意点：稀释：取滤液1ml，用甲醇水（7:3）进行稀释，依据国家对小麦、玉米中限量标准来进行适当稀释。比如：国家标准最大允许量为60ug/kg，那么滤液本应稀释3倍。但是因超标，所以加大稀释倍数，一般将上述稀释液再进行稀释5倍即可。试剂的配制：酶标二抗，洗涤液，DON单克隆抗体。实验设计：截取相当数量的反应孔；设定标准曲线孔（0、1.0、2.5、5.0、10、50ng/ml）；其余为样品孔。酶标仪测出吸光度，作为原始记录。软件计算。五、 实验中注意事项：1、 水：请用实验室用水（蒸馏水）；2、 标准品或提取液使用前：摇匀；3、 移

10、液器吸头不得重复使用；4、 终止液加入后，轻轻振摇12分钟，然后测定吸光度值（因考虑到颜色变化有延迟时间）。5、 试剂保存：28冷藏，酶标二抗和单克隆抗体血清管需冷冻储存。6、 大量样品检测时，为避免操作时间过长而引起的误差，请尽量使用排式移液器。六、 软件计算中的问题：1、 软件绘制的曲线评价：A0.1/A0的值在30%左右，拟合的曲线上对应浓度和标准浓度的相对偏差在5以内。2、 软件计算中稀释倍数的确定：滤液的稀释倍数（D）；AFB1含量（µg/kg）=C×V×Dm式中： C-从标准曲线上查得的AFB1的含量（ng/ml） V-样品提取液体积(ml)； D-样品稀释倍数；m-样品的质量(g)。注：若软件中已经将稀释倍数输入，则最后计算公式中不能将D再代入计算。七、 试剂盒集中采购，价格的优惠政策：1、 根据全国原粮卫生专项调查任务计划表来统计相应的试剂盒数量；2、 采购时请一定说明定量或定性检测试剂盒。3、 免费提供相关证书及资质证明。八、 粮食卫生标准GB2715-2005项目指标（g/kg）黄曲霉毒素B1玉米 大米 其他 20105脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）小麦、大麦、玉米及其成品粮1000玉米赤霉烯酮小麦、玉米 60赭曲霉