酵母核糖核酸的分离及组分鉴定

1、二、原理二、原理 酵母核酸中主要是酵母核酸中主要是RNA（2.6710.0），），DNA含量很含量很少（少（0.030.516），且菌体易于收集，），且菌体易于收集，RNA易分离。从酵易分离。从酵母中提取母中提取RNA的方法很多，常用的有的方法很多，常用的有稀碱法和浓盐法稀碱法和浓盐法。前者是。前者是利用利用稀碱使细胞壁溶解稀碱使细胞壁溶解，这种方法提取时间短，但是，这种方法提取时间短，但是RNA在此在此条件下条件下不稳定，易分解不稳定，易分解；后者是在加热的条件下，利用高浓度；后者是在加热的条件下，利用高浓度盐改变细胞膜的通透性，使盐改变细胞膜的通透性，使RNA释放出来，产品色泽较好。本释放

2、出来，产品色泽较好。本实验主要目的是提取核酸进行核酸组分鉴定，对实验主要目的是提取核酸进行核酸组分鉴定，对RNA稳定性要稳定性要求不严格，故采用稀碱法。求不严格，故采用稀碱法。酵母核糖核酸的分离及组分鉴定酵母核糖核酸的分离及组分鉴定 一、目的一、目的 了解从酵母中提取了解从酵母中提取RNA的原理、方法及其组分，掌握鉴定的原理、方法及其组分，掌握鉴定核酸组分的方法。核酸组分的方法。 核酸的水解可分为核酸的水解可分为化学水解化学水解和和酶促水解酶促水解，化学水解又可分，化学水解又可分为为酸水解和碱水解酸水解和碱水解。DNA对碱稳定，所以一般用对碱稳定，所以一般用酸水解酸水解DNA可得到碱基、脱氧核

3、糖和磷酸。由于可得到碱基、脱氧核糖和磷酸。由于RNA存在存在2OH，使磷，使磷酸二酯键对碱不稳定，酸二酯键对碱不稳定，碱解可获得单核苷酸碱解可获得单核苷酸；在碱提取液中加；在碱提取液中加入入酸性乙醇酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀。由此即得到溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀。由此即得到RNA的粗制品。加的粗制品。加硫酸煮沸硫酸煮沸可使其水解，可获得可使其水解，可获得核糖、磷酸、碱基核糖、磷酸、碱基（主要释放嘌呤碱，不易释放出嘧啶碱）。（主要释放嘌呤碱，不易释放出嘧啶碱）。 1.磷酸与定磷试剂作用可以生成蓝色的钼蓝磷酸与定磷试剂作用可以生成蓝色的钼蓝; 2.核糖与地衣酚试剂反应呈鲜绿色。脱氧核糖

4、与二苯胺试核糖与地衣酚试剂反应呈鲜绿色。脱氧核糖与二苯胺试剂反应生成蓝色化合物，而核糖无此反应剂反应生成蓝色化合物，而核糖无此反应; 3.嘌呤碱与硝酸银反应能产生白色的嘌呤银化合物沉淀。嘌呤碱与硝酸银反应能产生白色的嘌呤银化合物沉淀。三、材料和试剂干酵母定磷试剂四、操作四、操作 将将5g酵母悬浮于酵母悬浮于15mL0.04M氢氧化钠溶液中，并在乳钵氢氧化钠溶液中，并在乳钵中研磨均匀（此步是实验能否成功的关键，中研磨均匀（此步是实验能否成功的关键，至少至少10min）。将）。将悬浮液转移至锥形瓶中。再用悬浮液转移至锥形瓶中。再用10mL0.04M的氢氧化钠溶液分的氢氧化钠溶液分两次洗涤研钵，洗涤

5、液并入匀浆液中。将锥形瓶置于沸浴上加两次洗涤研钵，洗涤液并入匀浆液中。将锥形瓶置于沸浴上加热热30min后，将锥形瓶置于自来水中冷却。将匀浆转移到离心后，将锥形瓶置于自来水中冷却。将匀浆转移到离心管中，托盘天平上配平，离心管中，托盘天平上配平，离心4000r/min，8min，取上清液于，取上清液于洗净的锥形瓶中，并缓缓倾入二倍体积的洗净的锥形瓶中，并缓缓倾入二倍体积的PH=2.5酸性乙醇溶酸性乙醇溶液。注意要一边搅拌一边缓缓倾入。待核糖核酸沉淀完全后，液。注意要一边搅拌一边缓缓倾入。待核糖核酸沉淀完全后，再配平，离心再配平，离心 4000r/min ，5min。弃去上清液，取沉淀，即。弃去上

6、清液，取沉淀，即RNA粗品。用粗品。用1.5M的硫酸（约的硫酸（约5ml）将沉淀分几次转移到玻璃）将沉淀分几次转移到玻璃试管内，用沸水浴加热试管内，用沸水浴加热10min（时间太短可能致使组分鉴定实（时间太短可能致使组分鉴定实验失败）制成水解液并进行组分的鉴定。验失败）制成水解液并进行组分的鉴定。3.磷酸：磷酸：取一支试管，加入水解液取一支试管，加入水解液1毫升和定磷试剂毫升和定磷试剂l毫升。在水毫升。在水浴中加热，观察溶液是否变成蓝色，说明磷酸是否存在。浴中加热，观察溶液是否变成蓝色，说明磷酸是否存在。 2.核糖：核糖：取一支试管加入水解液取一支试管加入水解液1ml、 三氯化铁浓盐酸溶液三氯化铁浓盐酸溶液2ml和苔黑酚乙醇溶液和苔黑酚乙醇溶液0.2ml。 放沸水浴中放沸水浴中l0min。注意溶液是否变。注意溶液是否变成绿色，说明核糖的存在。成绿色，说明核糖的存在。1.嘌呤碱：嘌呤碱：取水