实验一糖类的颜色反应

1、第十六章 实验技术实验一 糖类的颜色反应一、实验目的1了解糖类某些颜色反应的原理。2学习应用糖的颜色反应鉴别糖类的方法。二、实验原理1.-萘酚反应（Molisch反应）原理糖在浓无机酸（硫酸、盐酸）作用下，脱水生成糠醛及糠醛衍生物，后者能与-萘酚生成紫红色物质。因为糠醛及糠醛衍生物对此反应均呈阳性，故此反应不是糖类的特异反应。2.间苯二酚反应（Seliwanoff反应）原理在酸作用下，酮糖脱水生成羟甲基糠醛，后者再与间苯二酚作用生成红色物质。此反应是酮糖的特异反应。醛糖在同样条件下呈色反应缓慢，只有在糖浓度较高或煮沸时间较长时，才呈微弱的阳性反应。在实验条件下蔗糖有可能水解而呈阳性反应。三、器

2、材1.试管及试管架 2.滴管3.水浴锅四、试剂1.莫氏（Molisch）试剂： 5% -萘酚的酒精溶液，称取-萘酚5g，溶于95%酒精中，并用此酒精使总体积达100mL，贮于棕色瓶内。此试剂需新鲜配制。2.塞氏（Seliwanoff）试剂：称取间苯二酚0.05g溶于30 mL浓盐酸中，再用蒸馏水稀释至100 mL，此试剂需新鲜配制。3.1%葡萄糖溶液：称取葡萄糖1g，溶于100mL蒸馏水中。4.1%果糖溶液：称取果糖1g，溶于100mL蒸馏水中。5.1%蔗糖溶液：称取蔗糖1g，溶于100mL蒸馏水中。6.1%淀粉溶液：称取可溶性淀粉1g与少量冷蒸馏水混合成薄浆状物，然后缓缓倾入沸蒸馏水中，边加

3、边搅，最后以沸蒸馏水稀释至100mL。7.0.1%糠醛溶液：称取糠醛0.1g，溶于100mL蒸馏水中。8.浓硫酸 500mL五、操作1.-萘酚反应（Molisch反应）取5支试管，分别加入1%葡萄糖溶液、1%果糖溶液、1%蔗糖溶液、1%淀粉溶液、0.1%糠醛溶液各1.5mL。再向5支试管中各加入2滴莫氏试剂，充分混合。斜执试管，沿管壁慢慢加入浓硫酸约2 / 311mL，慢慢立起试管，切勿摇动。浓硫酸在试液下形成两层。在二液分界处有紫红色环出现。观察、记录各管颜色。试剂现象解释现象1%葡萄糖溶液1%果糖溶液1%蔗糖溶液1%淀粉溶液0.1%糠醛溶液2.间苯二酚反应（Seliwanoff反应）取3支

4、试管，分别加入1%葡萄糖溶液、1%果糖溶液、1%蔗糖溶液各5mL。再向各管分别加入塞氏试剂2mL，混匀。将3支试管同时放入沸水浴中，注意观察、记录各管颜色的变化及变化时间。六、思考题1可用何种颜色反应鉴别酮糖的存在？2-萘酚反应的原理是什么？实验二 糖类的还原作用一、实验目的学习几种常用的鉴定糖类还原性的方法及其原理。二、实验原理许多糖类由于其分子中含有自由的或潜在的醛基或酮基，故在碱性溶液中能将铜、铋、汞、铁、银等金属离子还原，同时糖类本身被氧化成糖酸及其他产物。糖类这种性质常被利用于检测糖的还原性及还原糖的定量测定。本实验进行糖类的还原作用所用的试剂为斐林试剂和本尼迪克特试剂。它们都是含C

5、u2+的碱性溶液，能使还原糖氧化而本身被还原成红色或黄色的Cu2O沉淀。生成Cu2O沉淀的颜色之所以不同是由于在不同条件下产生的沉淀颗粒大小不同引起的，颗粒越小呈黄色，越大则呈红色。如有保护性胶体存在时，常生成黄色沉淀。三、器材1试管及试管架2竹试管夹3水浴锅4电炉四、试剂1斐林（Fehling）试剂菲林甲液（硫酸酮溶液）：称取34.5g硫酸铜（CuSO4·5H2O）溶于500mL蒸馏水中。菲林乙液（碱性酒石酸盐溶液）：称取125g氢氧化钠和137g洒石酸钾钠溶于500 mL蒸馏水中。为了避免变质，甲、乙二液分开保存。用前，将甲、乙二液等量混合即可。2本尼迪克特（Benedict）试

6、剂称取柠檬酸钠173g及碳酸钠（Na2CO3·H2O）100 g加入600mL蒸馏水中，加热使其溶解，冷却，稀释至850mL。另称取17.3g硫酸铜溶解于100 mL热蒸馏水中，冷却，稀释至150mL。最后，将硫酸铜溶液徐徐地加入柠檬酸钠-碳酸钠溶液中，边加边搅拌，混匀，如有沉淀，过滤后贮于试剂瓶中可长期使用。31%葡萄糖溶液：称取葡萄糖1g，溶于100mL蒸馏水中。41%果糖溶液：称取果糖1g，溶于100mL蒸馏水中。51%蔗糖溶液：称取蔗糖1g，溶于100mL蒸馏水中。61%麦芽糖溶液：称取麦芽糖1g，溶于100mL蒸馏水中。71%淀粉溶液：称取可溶性淀粉1g与少量冷蒸馏水混合成

7、薄浆状物，然后缓缓倾入沸蒸馏水中，边加边搅，最后以沸蒸馏水稀释至100mL。五、操作先取1支试管加入斐林试剂约 1mL，再加入4 mL蒸馏水，加热煮沸，如有沉淀生成，说明此试剂已不能使用。经检验，试剂合格后，再进行下述实验。取5支试管，分别加入菲林甲、乙液各1 mL，再向各试管分别加入1葡萄糖溶液、1果糖溶液、1蔗糖溶液、1麦芽糖溶液、1淀粉溶液各1mL。置沸水浴中加热数分钟，取出，冷却。观察各管溶液的变化。另取6支试管，用本尼迪克特试剂（每管加2mL）重复上述实验。比较两种方法的结果。斐林氏与本尼迪克特试法：溶液现象试剂1%葡萄糖溶液1%果糖溶液1%蔗糖溶液1%麦芽糖溶液1%淀粉溶液斐林氏试

8、剂本尼迪克试剂试解释以上表格现象：六、思考题1斐林氏、本尼迪克特试剂法检验糖的原理是什么？2你熟悉的糖中那些具有还原性？实验三 蛋白质的颜色反应一、实验目的熟悉一些常见蛋白质的颜色反应二、实验原理蛋白质分子中的某些基团与显色剂作用，可产生特定的颜色反应，不同蛋白质所含氨基酸不完全相同，颜色反应亦不同。颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质亦可产生相同颜色反应，因此不能仅根据颜色反应的结果决定被测物是否是蛋白质。颜色反应是一些常用的蛋白质定量测定的依据。重要的颜色反应有：1.双缩脲反应将尿素加热到180，则两分子尿素缩合而成一分子双缩脲，并放出一分子氨。双缩脲在碱性溶液中能与硫酸铜反应产生

9、红紫色络合物，此反应称双缩脲反应。蛋白质分子中含有许多和双缩脲结构相似的肽键，因此也能起双缩脲反应，形成红紫色络合物。通常可用此反应来定性鉴定蛋白质，也可根据反应产生的颜色在540nm 处比色，定量测定蛋白质。2.蛋白质的黄色反应黄色反应是含有芳香族氨基酸特别是含有酪氨酸和色氨酸的蛋白质所特有的呈色反应。蛋白质溶液遇硝酸后，先产生白色沉淀，加热则白色沉淀变成黄色，再加碱颜色加深呈橙黄色，这是因为硝酸将蛋白质分子中的苯环硝化，产生了黄色硝基苯衍生物。例如皮肤、指甲和毛发等遇浓硝酸会变成黄色。3.米伦氏反应米伦试剂为硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸和亚硝酸的混合物，蛋白质溶液加入米伦试剂后即产生白色沉淀，加

10、热后沉淀变成红色。酚类化合物有此反应，酪氨酸含有酚基，故酪氨酸及含有酪氨酸的蛋白质都有此反应。4.茚三酮反应蛋白质与茚三酮共热，则产生蓝紫色的还原茚三酮、茚三酮和氨的缩合物。此反应为一切氨基酸及-氨基酸所共有。含有氨基的其他物质亦呈此反应三、器材试管和试管架、滴管、水浴锅、酒精灯或电炉、量筒、滤纸片、烘箱、白明胶。四、试剂1. 卵清蛋白液：将鸡(鸭)蛋白用蒸馏水稀释2040倍，23层纱布过滤，滤液冷藏备用。2. 0.5%苯酚溶液：苯酚0.5mL，加蒸馏水稀释至100mL。3. 1%白明胶液：1g 白明胶溶于少量热水，完全溶解后，稀释至100mL。4. 米伦(Millon)试剂：40g 汞溶于6

11、0mL 浓硝酸(比重1.42)，水浴加温助溶，溶解后加2倍体积蒸馏水，混匀，静置澄清，取上清液备用。此试剂可长期保存。5. 0.1%茚三酮溶液：0.1g 茚三酮溶于95%乙醇并稀释至100mL。6.浓硝酸：比重1.42。7. 1%硫酸铜溶液：硫酸铜1g溶于蒸馏水中，稀释至100mL。8. 尿素：如颗粒较粗，最好研磨成粉末状。9. 10%氢氧化钠溶液：氢氧化难10g溶于蒸馏水，稀释至100mL。五、操作方法1.双缩脲反应取少许结晶尿素放在干燥试管中，微火加热，尿素溶化并形成双缩脲，释出的氨可用红色石蕊试纸试之。至试管内有白色固体出现，停止加热，冷却。然后加10%NaOH 溶液1mL 混匀，观察有

12、无紫色出现。另取一试管，加蛋白质溶液10滴，再加10% NaOH 溶液10滴及1%CuSO4溶液4滴，混匀，观察是否出现紫玫瑰色。注意事项：硫酸铜不能多加，否则将产生蓝色的Cu(OH)2。此外在碱溶液中氨或铵盐与铜盐作用生成深蓝色的络离子Cu(NH3)42+，妨碍此颜色反应的观察。2.蛋白质的黄色反应在一试管内，加蛋白质溶液10滴及浓硝酸34滴，加热，冷却后再加10%NaOH 溶液5滴，观察颜色反应。3.米伦氏反应 用苯酚做实验：取0.5%苯酚溶液1mL 于试管中，加米伦试剂约0.5mL(米伦试剂含有硝酸，如加入量过多，能使蛋白质呈黄色，加入量不超过试液体积的1/51/4)，小心加热，溶液即出

13、现玫瑰红色。 用蛋白质溶液做实验：取2mL 蛋白质溶液，加0.5mL 米伦试剂，此时出现蛋白质的沉淀(因试剂含汞盐及硝酸之故)，小心加热，凝固之蛋白质出现红色。注意事项：蛋白质溶液中如含有大量无机盐，可与汞产生沉淀从而丧失试剂的作用，如此试剂不能测定尿中的蛋白质。另外试液中还不能含有H2O2、醇或碱，因它们能使试剂中的汞变成氧化汞沉淀。遇碱必须先中和，但不能用盐酸中和。4.茚三酮反应取1mL 蛋白质溶液置于试管中，加2滴茚三酮试剂，加热至沸，即有蓝紫色出现(注意：此反应必须在pH57进行)。六、思考题1. 氨基酸与蛋白质具有哪些共同的颜色反应？说明原因。2. 蛋白质除了可以实验中的这些颜色反应

14、外，你还知道哪些蛋白质的颜色反应？实验四 蛋白质的沉淀反应一、实验目的加深对蛋白质的沉淀反应的认识，理解蛋白质沉淀反应的原理。二、实验原理蛋白质的水溶液是一种比较稳定的亲水胶体，这是因为蛋白质颗粒表面带有很多极性基团，如NH3+，COO-，SH，CONH2等，和水有高度亲和性，当蛋白质与水相遇时，就很容易被蛋白质吸住，在蛋白质颗粒外面形成一层水膜(又称水化层)。水膜的存在使蛋白颗粒相互隔开，颗粒之间不会碰撞而聚成大颗粒。因此蛋白质在溶液中比较稳定而不会沉淀。蛋白质能形成较稳定的亲水胶体的另一个原因，是因为蛋白质颗粒在非等电状态时带有相同电荷，使蛋白质颗粒之间相互排斥，保持一定距离，不致相互凝集

15、沉淀。蛋白质由于带有电荷和水膜，因此在水溶液中形成稳定的胶体。当某些物理化学因素破坏了蛋白质的水膜或中和了蛋白质的电荷，则蛋白质胶体溶液就不稳定而出现沉淀现象。 蛋白质可因加入下列试剂而产生沉淀：1. 加盐类如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等可以破坏蛋白质胶体周围的水膜，同时又中和了蛋白质分子的电荷，因此使蛋白质产生沉淀，这种加盐使蛋白质沉淀析出的现象称盐析。盐析法是分离制备蛋白质的常用方法，不同蛋白质盐析时所需的盐浓度不同，因此调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出，这种方法叫做分段盐析。但中性盐并不破坏蛋白质的分子结构和性质，因此，若除去或降低盐的浓度，蛋白质就会重新溶解。2.加有机

16、溶剂如酒精、丙酮等可使蛋白质产生沉淀，这是由于这些有机溶剂和水有较强的作用，破坏了蛋白质分子周围的水膜，因此发生沉淀作用。若及时将蛋白质沉淀与丙酮或乙醇分离，蛋白质沉淀则可重新溶解于水中。3.重金属盐如氯化汞、硝酸银、醋酸铅及三氯化铁等。这是因为蛋白质在碱性溶液中带负离子，可与这些重金属的正离子作用而生成不易溶解的盐而沉淀。4.某些酸类如苦味酸、单宁酸、三氯乙酸等能和蛋白质化合成不溶解的蛋白质盐而沉淀。用盐析法或低温下加入丙酮、乙醇使蛋白质沉淀，以及利用等电点的沉淀反应时，虽然蛋白质已经沉淀析出，然而其分子内部结构并没发生明显的改变，仍保持原有的生物活性。如除去沉淀因素，蛋白质可重新溶解在原来

17、的溶剂中。因此，这种沉淀作用称为可逆沉淀作用。但如在温度较高情况下加入有机溶剂来沉淀分离蛋白质或已用有机溶剂沉淀分离得到的蛋白质没有及时与有机溶剂分开，都会引起蛋白质的性质发生改变，这应该注意。三、器材试管及试管架、吸管、抽滤瓶、量筒、布氏漏斗。四、试剂1. 蛋白质氯化钠溶液取20mL 蛋清，加蒸馏水200mL 和饱和氯化钠溶液100mL，充分搅匀后纱布滤去不溶物(加氯化钠的目的是溶解球蛋白)。2. 蛋白质溶液 取5mL 蛋清，用蒸馏水稀释至100mL，搅拌均匀后，用纱布过滤。3. 饱和硫酸铵溶液：称硫酸铵850g 加于1000mL 蒸馏水中，在7080下搅拌促溶，室温中放置过夜，瓶底析出白色

18、结晶，上清液即为饱和硫酸铵溶液。4. 饱和苦味酸溶液：取2g 苦味酸放入三角烧瓶，加蒸馏水100mL，80水浴约10min 使之完全溶解，于室温下冷却后瓶底析出黄色结晶，上清液即为饱和苦味酸，此液可存放数年。5. 1%醋酸溶液、1%醋酸铅溶液、1%硫酸铜溶液、1%三氯乙酸溶液。6. 0.5%磺基水杨酸溶液。7. 5%鞣酸溶液。8. 硫酸铵粉末。五、操作1.盐析作用：取1支试管加入3mL 蛋白质氯化钠溶液和3mL 饱和硫酸铵溶液，混匀，静置约10min，球蛋白则沉淀析出。过滤后向滤液中加入硫酸铵粉末，边加边用玻璃棒搅拌，直至粉末不再溶解达到饱和为止，析出的沉淀为清蛋白，再加水稀释，观察沉淀是否溶

19、解。2.乙醇沉淀蛋白质：取1支试管架蛋白质溶液1mL，加晶体氯化钠少许(加速沉淀并使沉淀完全)待溶解后再加入95%乙醇2mL 混匀。观察有无沉淀析出。3.有机酸沉淀蛋白质：取2支试管，各加入蛋白质溶液约0.5mL，然后分别滴加10%三氯乙酸和0.5%磺基水杨酸数滴。观察蛋白质沉淀。4.重金属盐沉淀蛋白质取：2支试管各加蛋白质溶液2mL，一管内滴加1%醋酸铅溶液，另一管内滴加1%硫酸铜溶液，观察沉淀生成。5.生物碱试剂沉淀蛋白质取：2支试管，各加蛋白溶液2mL 及1%醋酸45滴。其中一管滴加5%鞣酸，另一管滴加饱和的苦味酸溶液，观察沉淀的形成。六、思考题1.蛋白质的中性盐沉淀和重金属沉淀有何差别

20、？各有什么用途？ 2.为什么鸡蛋清可作为铅或汞中毒的解毒剂？实验五 蛋白质等电点测定一、实验目的掌握蛋白质等电点的测定方法及其原理。了解等电点的意义及其与分子聚沉能力的关系。二、实验原理蛋白质同氨基酸一样，是两性电解质，在不同的pH 水溶液中解离后所带正、负电荷不同。调节溶液的酸碱度达到一定的氢离子浓度时，蛋白质分子所带的正电荷和负电荷相等，以兼性离子状态出现，在电场内该蛋白质分子既不向阴极移动，也不向阳极移动，这时溶液的pH 值称为该蛋白质的等电点(pI)。各种蛋白质具有特定的等电点，这时和它所含的氨基酸的种类和数量有关。如蛋白质分子中含碱性氨基酸较多，其等电点偏碱。例如从雄性鱼类成熟精子中

21、提取的鱼精蛋白含精氨酸特多，其等电点为12.012.4。如蛋白质分子中含酸性氨基酸较多，则其等电点偏酸。例如胃蛋白酶含酸性氨基酸残基为37个，而碱性氨基酸残基仅含6个，其等电点为1.0左右。含酸性和碱性氨基酸残基数目相近的蛋白质，其等电点大多为中性偏酸，约5.0左右。蛋白质等电点多接近于pH7.0，略偏酸性的等电点也较多。处于等电点的蛋白质表现电中性，所以在溶液中的稳定性很低，容易沉淀析出。将酪蛋白溶液分置于连续不同的pH 环境中，通过观察混浊程度可测得酪蛋白的等电点。三、器材试管和试管架、滴管、吸管(1和5mL)、容量瓶。四、试剂1. 酪蛋白醋酸钠溶液：称取纯酪蛋白0.25g，加蒸馏水20m

22、L 及1.00mol/L 氢氧化钠溶液5mL(必须准确)。摇荡使酪蛋白溶解。然后加1.00mol/L 醋酸5mL(必须准确)，倒入50mL 容量瓶内，用蒸馏水稀释至刻度，混匀，结果酪蛋白溶于0.10mol/L 醋酸钠溶液内，其浓度为0.5%。2. 0.01mol/L 醋酸溶液3. 1.00mol/L 醋酸溶液4. 0.10mol/L 醋酸溶液5. 1.00mol/L 氢氧化钠溶液（氢氧化钠和醋酸的浓度要标定）五、操作1.取9支粗细相近的干燥试管，编好号后按表5-1的顺序准确地加入各种试剂。2.加完后观察上述各管的混浊程度，静置约20min，再视其沉淀情况，以-，+，+，+，+符号表示沉淀的多少

23、。根据观察的结果，指出哪一个pH 是酪蛋白的等电点(混浊显著或静置后沉淀最多，上部溶液变得最清亮一管的pH 值，即为酪蛋白的等电点)。3. 该试管要求各种试剂的浓度和加入量必须相当准确。除了需要精心配制试剂以外，实验中应该严格按照定量分析的操作进行。为了保证实验的重复性或为了进行大批 量的测定，可以事先按照上述的比例配制成大量的9种不同浓度的醋酸溶液。实验时分别准确吸取4mL该溶液，再各加入1mL酪蛋白醋酸钠溶液。表5-1 试剂加入及数据记录表管号酪蛋白醋酸钠溶液（毫升）水（毫升）0.01mol/L醋酸（毫升）0.10mol/L醋酸（毫升）1.00mol/L醋酸（毫升）pH观察沉淀出现情况0分

24、钟10分钟20分钟118.380.625.9217.751.255.6318.750.255.3418.500.505.0518.001.004.7617.002.004.4715.004.004.1811.008.003.8917.401.603.5六、思考题1.该方法测定蛋白质等电点的原理是什么？2.蛋白质等电点在实际生产上有何意义？实验六 酪蛋白的制备等电点沉淀法一、实验目的1、了解等电点沉淀法2、学习从牛奶中制备酪蛋白的方法3、加深对蛋白质等电点性质的理解二、实验原理蛋白质是一种亲水胶体，在水溶液中蛋白质分子表面形成一个水化层。另外，蛋白质又是一种两性离子，在一定pH溶液能够维持一个稳

25、定的状态。但是调节蛋白质溶液的pH值至等电点时，蛋白质会因失去电荷而变得不稳定，此时若再加脱水剂或加热，水化层被破坏，蛋白质分子就相互凝聚而析出。等电点沉淀法主要利用两性电解质分子在等电点时溶解度最低的原理，而多种两性电解质具有不同等电点而进行分离的一种方法。牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀，除去脂类杂质后便可得到较纯的酪蛋白。但单独利用等电点沉淀法来分离生化产品效果并不太理想，因为即使在等电点时，有些两性物质仍有一定的溶解度，并不是所有的蛋白质在等电点时都能沉淀下来，特别是

26、同一类两性物质的等电点十分接近时。生产中常与有机溶剂沉淀法、盐析法并用，这样沉淀的效果较好。三、器材离心机、抽滤装置（布氏漏斗）、电炉、温度计、天平、表面皿、烧杯、容量瓶、移液管、酸度计。四、试剂（1）鲜牛奶；（2）0.5mol/L HCl；（3）0.5 mol/L NaOH；（4）95乙醇；（5）无水之醚；（6）0.2mol/LpH4.7醋酸醋酸钠缓冲液，先配制A液与B液。（A液：0.2 mol/L醋酸钠溶液：称NaAC·3H2O  54.44g，定容至2 000 mL。B液：0.2 mol/L醋酸溶液。称取优级纯醋酸（含量大于99.8）12g定容至1 000 mL。取A

27、液1 770 mL，B液1 230mL混合即得pH4.7的醋酸钠醋酸缓冲液3 000 mL。）；（7）乙醇乙醚混合液。乙醇：乙醚1：1（VV）。五、操作1.将50mL牛奶加热到40。在搅拌下慢慢加入预热到40的pH4.7的醋酸缓冲液50mL。用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7。将上述悬浮液冷至室温。离心15 min(2000 r/min)，弃去清液，得酪蛋白粗制品。2.用水洗沉淀，离心10 min(3000 r/min)，弃去上清液；如此操作三次。3.在沉淀中加入30mL乙醇。搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇乙醚混合液洗沉淀两次。最后用乙醚洗沉淀两次，抽干。4.将沉淀摊开在

28、表面皿上，风干得酪蛋白纯品。5.准确称重，计算含量和得率。含量：酪蛋白g/100mL牛乳。式中理论含量为3.5g/100mL牛乳。六、思考题1.为什么调整溶液的pH值可将酪蛋白沉淀出来？2.你还可以采用哪些其他的方法来制备酪蛋白？3.制备高产率纯酪蛋白的关键是什么？实验七 氨基酸的纸层析一、实验目的1.了解并掌握氨基酸纸层析的原理和方法。2.学习纸层析法的操作技术，分析未知样品氨基酸的成分。二、实验原理用滤纸为支持物进行层析的方法，称为纸层析法，它是分配层析法的一种。纸层析所用的展层溶剂大多是由水饱和的有机溶剂组成。滤纸纤维的OH 基的亲水性基团，可吸附有机溶剂中的水作为固定相，有机溶剂作为流

29、动相，它沿滤纸自下向上移动，称为上行层析；反之，使有机溶剂自上而下移动，称为下行层析。将样品点在滤纸上进行展层，样品中的各种氨基酸即在二相中不断进行分配，由于它们各自的分配系数不同，故在流动相中移动速率不等，从而使不同的氨基酸得到分离和提纯。纸层析法主要是依据混合组分对二相分配系数的差异进行分离，但亦存在着某种程度的吸附作用和离子交换现象。氨基酸经层析在滤纸上形成距原点不等的层析点，氨基酸在滤纸上的移动速率用Rf 表示。Rf = 原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离只要实验条件(如温度、展层溶剂的组分、pH、滤纸的质量等)不变，Rf 值是常数，因此可做定性分析参考。Rf值的大小与物质

30、的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。由于氨基酸无色，可利用茚三酮反应使氨基酸层析点显色，从而定性和定量。三、器材1层析缸2毛细管3喷雾器4培养皿5层析滤纸（新华一号）6小烧杯（50mL）7铅笔8直尺四、试剂1.展层剂：正丁醇80%甲酸水 = 1532(V/V)，摇匀后放置半天以上，取上清液备用。2.氨基酸溶液（用0.01mol/L的盐酸配制）：0.5的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液（各组份浓度均为0.5）。3.显色剂：0.1%水合茚三铜正丁醇容液。五、操作1将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中。2取层析滤纸（

31、长22cm、宽15cm）一张。在纸的一端距边缘23cm处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔2cm作一记号如下图。3点样 用毛细管将各氨基酸样品分别点在这6个位置上，干后再点一次。每点在纸上扩散的直径最大不超过3mm。4扩展 用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。将盛有约20 mL扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1cm）。待溶剂上升 1520 cm时即取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。5显色 用喷雾器均匀喷上0.1茚三酮正丁醇溶液，然后置80烘箱中烘烤35分钟或用热风吹干即可显出各层析斑点。6计算各

32、种氨基酸的Rf值。六、思考题1何谓纸层析法？2何谓Rf值？影响Rf值的主要因素是什么？3怎样制备展层剂？4层析缸中平衡溶剂的作用是什么？实验八 电泳技术纸电泳分离氨基酸一、实验目的1.了解电泳技术的基本原理；2.掌握纸上电泳的原理和操作技术。二、实验原理带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳（electrophoresis）。电泳现象早在1808年就被发现，但是作为一项生物化学研究的方法学，却是在1937年Tiselius在电泳仪器方面取得重大成就后，才得到较大的进展。特别是后来应用滤纸作为支持物，形成了设备简单，操作方便的纸上电泳法后，电泳技术在生物化学和其他领域研究中

33、得到了广泛的应用和发展。近年来，由于采用多种新型支持物，仪器装置亦得到不断改进，因此出现了许多新型的电泳技术。目前所采用的电泳方法，大致可分为三类：显微电泳，自由界面电泳和区带电泳。区带电泳应用比较广泛，按其支持物物理性状的不同可分成4大类：1.滤纸及其他纤维（如玻璃纤维、醋酸纤维、聚氯乙烯纤维）薄膜电泳。2.凝胶电泳：如琼脂、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶电泳。3.粉末电泳：如纤维素粉、淀粉、玻璃分电泳。4.线丝电泳：如尼龙丝，人造丝电泳。此为微量电泳方法。区带电泳现已广泛应用于生物化学物质的分析分离以及临床检验等方面。现以纸上电泳为例介绍有关电泳的原理和操作技术。任一物质质点，由于其本身的解离作

34、用或由于表面上吸附有其他带电质点，在电场中便会向一定的电极移动。例如氨基酸、蛋白质分子等，由于它具有许多可解离的酸性基团和碱性基团，如-COO和-NH3+等，它是一典型的两性电解质，在一定的pH条件下，就会解离而带电，带电的性质和多少决定于蛋白质分子的性质及溶液的pH值和离子强度。在某一pH条件下，蛋白质分子所带的正电荷数恰好等于负电荷数，即净电荷等于零。此时蛋白质质点在电场中不移动，溶液的这pH值，称为该蛋白质的等电点(pI)。如果溶液的pH小于pI，则蛋白质分子结合一部分H，而带正电荷，在电场中就会向负极移动。反之，溶液的pH大于pI，则蛋白质分子会解离出部分H而带有负电，此时蛋白质分子在

35、电场中就会向正极移动。不同的带电颗粒在同电场中泳动速度不同，常用迁移率(或称泳动度，mobility)来表示。迁移率的定义是带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。式中：m为迁移率(cm2/V·s)；v为颗粒的泳动速度(cm/s)；E为电场强度(V/cm)；d为颗粒泳动的距离(cm)；l为滤纸的有效长度(cm)，即滤纸与两极溶液交界面间的距离；V为实际电压(V)；t为通电时间秒(s)。通过测量d，l，v，t便可计算出颗粒的迁移率。带电颗粒在电场中的泳动速度与本身所带净电荷的量，颗粒的大小和形状有关。一般说，所带净电荷量愈多，颗粒愈小，愈接近球形，则在电场中的泳动速度愈快，反之则愈慢。泳动

36、速度除受颗粒本身性质的影响外，还和其他外界因素有关。现将影响颗粒泳动速度的外界因素讨论如下：1、电场强度：电场强度是指每lcm的电位降，也称电位梯度(电势梯度)。电场强度对泳动速度起着决定性作用。电场强度愈高，则带电颗粒泳动愈快。例如进行纸上电泳时，滤纸两端相距20cm处测得电位降为200V，则电场强度为200/2010V/cm。纸上电泳根据电场强度的大小可分为常压(100500V)纸上电泳和高压(2 00010 000V)纸上电泳，前者电场强度一般为210V/cm，分离时间较长，从数小时到数天。后者电场强度为50200V/cm，电泳时间很短；有时仅需数分钟。常压纸上电泳多用于分离蛋白质等大分

37、子物质，高压纸上电泳则多用来分离氨基酸，多肽、核苷酸、糖类等小分子物质。2、溶液的pH值；溶液的pH值决定带电颗粒解离的程度，亦即决定其所带净电荷的多少。对蛋白质两性电解质而言，pH值离等电点越远，则颗粒所带净电荷越多，泳动速度也越快，反之，则越慢。因此当分离某一蛋白质混合物时，应选择一个合适的pH，使各种蛋白质所带的电荷量差异较大，有利于彼此分开。为了使电泳过程中溶液pH值恒定，必须采用缓冲溶液。3、溶液的离子强度：离子强度影响颗粒的电动电势()，溶液的离子强度越高，电动电势越小，则泳动速度越慢；反之，则越快。一般最适的离子强度在0.020.2之间。溶液离子强度的计算方法如下：式中：I为溶液

38、的离子强度；C为离子的摩尔浓度；Z为离子的价数。4、电渗：在电场中，由于多孔支持物吸附水中的正或负离子使溶液相对带电，在电场作用下，溶液就向一定方向移动，称为电渗现象。在纸上电泳中，由于纸上吸附OH-离子带负电荷，而与纸相接触的水溶液带正电荷，液体便向负极移动，移动时可携带颗粒同时移动。所以电泳时颗粒泳动的表面速度是颗粒本身的泳动速度与由于电渗影响而被携带的移动速度两者的加和。若是颗粒原来向负极移动，则其表观速度将比泳动速度快，若原来向正极移动，则其表观速度将比泳动速度慢。为了校正这一误差，可用一中性物质如糊精，蔗糖或葡聚糖等与样品平行作纸上电泳，然后将其移动距离自实验结果中除去。5、滤纸的选

39、择：要求纸质均匀和吸附力小，否则电场强度不均匀，使结果不能重复，并得不到好的图谱。如果吸附力大，则蛋白质或其他胶体在它们泳动的过程中有一部分被纸所吸附，以致于泳动快的部分其相对含量降低。因此常将滤纸事先处理，以减低滤纸的吸附能力，使达到更好的分离效果。若选用国产新华滤纸，或WhatmanNo.1号滤纸，一般不必再进行预处理。6、其他因素：例如缓冲溶液的粘度。缓冲溶液与带电颗粒的相互作用以及电泳时温度的变化等因素，也都影响泳动速度。 本实验以混合氨基酸为材料，用纸上电泳法分离其中的不同氨基酸。三、器材水平式电泳槽、电泳仪、吹风机、点样器、喷雾器、铅笔、杭州新华滤纸或WhatmanNo.1号滤纸四

40、、试剂1、1/15mol/L磷酸盐缓冲液(离子强度0.08，pH6.0) 配制方法：甲液：1/15mol/L Na2HPO4溶液（Na2HPO4 9.465g；蒸馏水加至1000mL）乙液：l/15mol/L KH2PO4溶液 （KH2PO4 9.07g；蒸馏水加至1000mL） 分装在棕色瓶内，于4冰箱中保存，用时甲、乙两液各按19比例混合，即可得所需pH的缓冲液。2、1%丙氨酸、1%谷氨酸、1%赖氨酸标准溶液。吸取上述氨基酸标准溶液各10mL于50mL烧杯中配成混合样品。      3、显色液（0.5%茚三酮丙酮溶液）五

41、、操作1、仪器及样品的准备将电泳槽洗净，晾干、放平。然后量取约700800mL缓冲液先倒入电泳槽，使两端液面达到平衡。  2、滤纸的剪裁用刀片将新华滤纸或WhatmanNo.1号滤纸，裁成长21.5cm，宽13.8cm的滤纸条，并按以下规格用铅笔作上正负记号。剪裁前要选择纸质比较均匀的纸，用刀片裁整齐，注意纸边不能有缺刻或起毛，可先用废纸条练习，然后再正式裁剪。3、点样1）原点的位置和形状：对于一个未知样品，初次实验时，应将样品点在滤纸条的中央，观察区带的两极泳动情况，即可选择出点样位置。样品可点成长条形，或圆点状。一般长条形分离效果较好，但样品很少时，点成圆点，样品比较集中，便于显

42、色。但双向电泳或一向电泳、一向层析结合使用时则必须点成圆点或椭圆点，不能点成长条。2）点样量：随滤纸的厚度，原点的宽度，样品的溶解度，显色方法的灵敏度，样品迁移率的差异而有所不同。样品量过多时拖尾和扩散比较严重，不能获得最有效的分离。样品量太少时，将无法检出。 3）点样方法：可分干点法和湿点法两种。湿点法：先将滤纸用喷雾器均匀地喷上缓冲液，或将滤纸浸于缓冲液中，浸透后取出，夹在两普通滤纸中，轻压，将多余缓冲液吸去。缓冲液与干纸重量比为1.212.51。然后架起滤纸，在纸上用点样管将样品画成长条形。注意画线要直，且粗细均匀，千万不可将滤纸画毛，损伤纸面。以湿点法点样品时，点的次数不宜多，因此如果

43、样品浓度较低时，必须事先浓缩。干点法：将样品点于纸上，待第一次样品晾干，再点第二次。画线必须细直，粗细均匀，直到将所需要的样品全部点完为止。可用吹风机冷风加速干燥，而后小心地用喷雾器将滤纸两端喷湿，有样品处空出，让其缓冲液经扩散而自行湿润。或将滤纸除样品部分外浸于缓冲液中，放置片刻，样品部分靠毛细管作用而湿润，多余缓冲液用普通滤纸吸去。干点法和湿点法各有利弊，干点法虽然在点样过程中起浓缩的作用，但点的次数多时，纸面容易受损，样品干坏。湿点法虽不宜用作稀的样品，却可保持样品的天然状态。点样前，可用废滤纸条先以水代替样品进行练习，当操作熟练后再正式点样。本次实验采用干法点样，在滤纸的中间位置横着划

44、一直线，在直线上每隔23cm作一记号“×”，用毛细管分别吸取标准丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸各3uL及混合液10uL，小心点于滤纸上，点样直径不能大于0.5cm，每点一次用电风筒吹干，再点第二次，再吹干，直到点完。4、电泳 将滤纸架放入电泳槽中，标有正号的一端应放在正极槽内，负号的一端放在负极槽内。并把滤纸条拉紧，使其成为平面，避免中间下垂。盖上玻璃盖，关闭电泳槽中间活塞，检查好线路。然后打开电源开关，调整电压到250V左右，并观察或测量其电流数值，记下通电时间。为了计算迁移率，要用万用电表测量滤纸的有效长度两端的实际电压，记下读数。5、烘干 通电0.5小时后，关闭电源开关，在滤纸与溶液交

45、界处作上记号(以便测量长度l)，然后将滤纸条由滤纸架上取下，分别平插在具有两排细针的木架上放入105烘箱中烘干15分钟。或吹干。6、染色浸显色剂。 7、吹干至出现斑点。8、绘出结果图，指出各斑点的氨基酸酸碱性质并说明你判断的依据。六、思考题1.A pI=9，B pI=11。设计一个最佳电泳分离方案。2.电泳技术可否用于定量分析？实验九 酶的催化特性一、实验目的通过本实验了解酶催化的特异性以及pH、温度、抑制剂和激活剂对酶活力的影响二、实验原理酶与一般催化剂最主要的区别之一是酶具有高度特异（专一）性，即一种酶只能对一种底物或一类底物（此类底物在结构上通常具有相同的化学键）起催化作用，对

46、其他底物无催化反应。例如，淀粉酶和蔗糖酶虽然都是催化糖苷键的水解，但是淀粉酶只对淀粉起作用，蔗糖酶只水解蔗糖。还原糖产物可用班尼迪克特试剂鉴定。通过比较淀粉酶在不同pH、不同温度以及有无抑制剂或激活剂时水解淀粉的差异，说明这些环境因素与酶活性的关系。三、器材恒温水浴（37，70）、沸水浴（100）、冰浴（0），试管18×180共19支，吸管1mL7支、2mL3支、5mL5支，量筒100mL1个，白瓷板，胶头滴管3支四、试剂2%蔗糖溶液：用分析纯蔗糖新鲜配制。1%淀粉溶液：1g淀粉和0.3g NaCl，用5mL蒸馏水悬浮，慢慢倒入60mL煮沸的蒸馏水中，煮沸1min，冷却至室温，加水到

47、100mL，冰箱贮存。0.1%淀粉溶液：0.1g淀粉，以5mL水悬浮，慢慢倒入60mL煮沸的蒸馏水中，煮沸1min，冷却至室温，加水到100mL，冰箱贮存。班尼迪克特（Benedict）试剂：17.3g 无水硫酸铜，加100mL蒸馏水加热溶解，冷却；173g柠檬酸钠和100g无水碳酸钠，以600mL蒸馏水加热溶解，边加边搅匀，最后定容至1000mL。如有沉淀可过滤除去，此试剂可长期保存。碘液：2g碘化钾溶于5mL蒸馏水中，加1g碘，溶解后再加295mL水，混匀贮存于棕色瓶中。磷酸缓冲液：A液：0.2mol/L Na2HPO4称取28.40g Na2HPO4(或71.64g Na2HPO412H

48、2O)溶于1000mL水中。B液：0.1mol/L 柠檬酸称取21.01g柠檬酸（C6H8O7H2O）溶于1000mL水中。pH5.0缓冲液：10.30mL A液+9.70mL B液pH7.0缓冲液：16.47mL A液+3.53mL B液pH8.0缓冲液：19.45mL A液+0.55mL B液1% CuSO45H2O溶液。1% NaCl。唾液淀粉酶溶液：先用蒸馏水漱口，再含10mL左右蒸馏水，轻轻漱动，2分钟后吐出收集在烧杯中，即得清澈的唾液淀粉酶原液，根据酶活高低稀释50倍，即为唾液淀粉酶溶液。蔗糖酶溶液：取1g鲜酵母或干酵母放入研钵中，加入少量石英砂和水研磨，加50mL蒸馏水，静置片刻

49、，过滤即得。五、操作1、酶催化的专一性  取6支干净试管，按下表操作：操作项目管号1234561%淀粉(mL)1100102%蔗糖(mL)001101唾液淀粉酶原液(mL)101000蔗糖酶溶液(mL)010100蒸馏水(mL)000011酶促水解摇匀，37水浴中保温10min班尼迪克特试剂(mL)222222反应摇匀，沸水浴中加热510min现象2、pH对酶活力的影响 取3支试管，按下表操作：操作项目管号123pH5.0磷酸缓冲液(mL)300pH7.0磷酸缓冲液(mL)030pH8.0磷酸缓冲液(mL)0031%淀粉溶液(mL)111预保温混匀，37水浴中保温

50、2min唾液淀粉酶溶液(mL)111检查淀粉水解程度    摇匀，置37水浴中继续反应2分钟，每隔1分钟从第2号管中取出1滴反应液于白瓷板上，加碘液检查反应进行情况，直至反应液不再变色，即可停止反应，取出所有试管。碘液(滴)111现象3、温度对酶活力的影响  取3支试管，按下表操作：操作项目管号123唾液淀粉酶溶液(mL)111pH7.0磷酸缓冲液(mL)222温度预处理5min（）037701%淀粉溶液(mL)222摇匀，保持各自温度继续反应，5分钟后每隔1分钟从第2号管吸取1滴反应液于白瓷板上，用碘液检查反应进行情况，直至反应液不再变色（只

51、有碘液的颜色），立即取出所有试管，流水冷却2min，各加1滴碘液，混匀。观察并记录各管反应现象，解释之。4、酶的抑制与激活操作项目管号1231% NaCl(mL)1001% CuSO4(mL)010蒸馏水(mL)001唾液淀粉酶溶液(mL)1110.1%淀粉溶液(mL)333保温反应并检查淀粉水解程度    摇匀，37水浴反应1min左右即可用碘液检查1号试管淀粉水解程度，待1号试管的反应液不再变色时取出所有试管。碘液(滴)111现象注意事项（1）各人唾液中淀粉酶活力不同，因此实验2、3、4应随时检查反应进行情况。如反应进行得太快，应适当稀释唾液；反之，则应减少唾

52、液淀粉酶稀释倍数。（2）酶的抑制与激活最好用经透析的唾液，因为唾液中含有少量Cl。另外，注意不要在检查反应程度时使各管溶液混杂。六、思考题：1.何谓酶的最适pH和最适温度？2.说明底物浓度、酶浓度、温度和pH对酶反应速度的影响。3. 酶作为一种生物催化剂，有哪些催化特点？实验十 糖化酶活力测定一、实验目的1、 学习糖化型淀粉酶(或液体曲)酶活力的测定方法。2、 了解糖化型淀粉酶活力大小对工艺生产的指导意义。二、实验原理糖化型淀粉酶可催化淀粉水解生成葡萄糖。本实验在一定条件下用一定量的糖化型淀粉酶作用于淀粉，然后用碘量法测定所生成的葡萄糖的含量来计算淀粉酶的活力。碘量法定糖原理：淀粉经糖化酶水解

53、生成葡萄糖，葡萄搪具有还原性，其羰基易被弱氧化剂次碘酸钠所氧化：体系中加入过量的碘，氧化反应完成后用硫代替硫酸钠滴定过量的碘，即可推算出酶的活力。I22Na2S2O3 = Na2S4O6 2NaI三、器材仪器吸管(25mL，5mL，2mL，10mL)、定碘瓶(500mL)、 碱式滴定管、烧杯、恒温水浴锅、分析天平。原料：待测酶液四、试剂1. 2%可溶性淀粉溶液：准确称取2克可溶性淀粉(预先于100105烘干至恒重约2小时)，加少量蒸馏水调匀。倾入80mL左右的沸蒸馏水中，继续煮沸至透明，冷却后用水定容至100mL。2. 0.05 mol/L碘液：称取25克碘化钾溶于少量水中，加入12.7克碘，

54、溶解后定容至1000mL。3. pH4.5的1mol/L醋酸缓冲液：称取8.204克无水醋酸钠，先在少量水中溶解，定容至1000mL。取分析纯冰醋酸5.78mL定容至1000mL。以上两种溶液按醋酸和醋酸钠的体积比为25：22混合即为所要求之缓冲液。4. 0.1 mol/L氢氧化钠溶液：称取分析纯氢氧化钠4克溶解并定容至1000mL。5. 1mol/L硫酸 ：吸取分析纯浓硫酸(比重1.84)55.5mL，缓缓如入944.5mL水定容至1000mL。6. 0.1mol/L硫代硫酸钠：称取25克硫代硫酸钠(Na2S2O3·5H2O)和0.4克碳酸钠，用煮沸冷却的蒸馏水溶解并定容至1000

55、mL，配制后放置三天再标定。五、操作取2可溶性淀粉溶液25mL加pH4.5醋酸缓冲液5mL混匀，在40恒温水浴中预热510分钟加入待测酶液2mL准确计时1小时。取出加入4滴20NaOH终止酶反应，冷却至室温。取上述反应液5mL于定容瓶中，先加入0.05mol/L碘液10mL，再加0.1 mol/L NaOH 10mL，摇匀暗处静置15分钟。加入1mol/L硫酸2mL。用0.1mol/L的硫代硫酸钠滴定至无色，记录滴定值B mL。并以蒸馏水代替酶液，同法保温后测定，记录消耗硫代硫酸钠的体积AmL。其与空白消耗硫代硫酸钠毫升数的差值应在46之间，否则要适当调整酶液的稀释倍数。六、计算 A空白所消耗的Na2S2O3的毫升数； B样品所消耗的Na2S