γδT细胞在变应原雾化吸入减敏防治过敏性支气管哮喘中的作用

1、T细胞在变应原雾化吸入减敏防治过敏性支气管哮喘中的作用         11-01-31 13:30:00     编辑：studa20                   作者：姜晓红, 李超乾*, 何英, 邓家珍, 覃惠清, 梁国容【摘要】  目的: 探讨T细胞在过敏性支气管哮喘发病机

2、制中的作用。方法: 来自门诊的40例粉尘螨和屋尘螨点刺阳性、 部分控制过敏性支气管哮喘患者随机分为常规治疗组(A组)和吸入减敏组（B组）, 每组各20例。所有患者接受相同的基础治疗, 常规治疗组雾化吸入生理盐水5 mL、 吸入减敏组雾化吸入特异性变应原, 每周2次, 持续6个月。治疗前后用流式细胞术（FCM）检测外周血及诱导痰中T细胞占淋巴细胞百分比; IL4+、 IFN+T细胞占淋巴细胞百分比。结果: 治疗后B组外周血、 诱导痰中T细胞占淋巴细胞百分比低于治疗前; B组外周血和诱导痰中IFN+T细胞占淋巴细胞百分比增高。结论: 特异性变应原雾化吸入减敏疗法有效防治哮喘可能与T细胞有关; T细

3、胞可能参与哮喘发病机制。 【关键词】  减敏 哮喘 T细胞 IL 4 IFN Abstract  AIM: To explore the role of T cells in the pathogenesis of allergic bronchial asthma. METHODS: Forty patients with Der.p and Der f allergy and partlycontrolled asthma were involved in a random study. Besides the fact that all patients were t

4、reated with same basic treatment. Patients in group A were nebulized with 5 mL normal saline while group B with specific allergen twice a week for six months. The percentage of T cells in peripheral blood and induced sputum and the percentage of IL4+ and IFN+ T cells were detected by flow cytometry(

5、FCM) before and after treatment. RESULTS: The percentage of T cells in group B decreased after treatment, and the percentage of IFN+ T cells in both peripheral blood and induced sputum increased significantly in group B than that in group A. CONCLUSION: T cells, which may participate in the pathogen

6、esis of bronchial asthma, may contribute to the prevention and treatment of bronchial asthma by desensitization of allergen nebulization.Keywordshyposensitization; asthma; gamma/delta T cells; interleukin4; interferon支气管哮喘是呼吸道常见疾病, 其病因和发病机制相当复杂, 给临床防治带来一定的困难。特异性变应原免疫疗法是惟一针对哮喘病因的治疗方法, 自20世纪80年代以来, 由于

7、抗原进一步提纯标化, 注射方法规范化, 免疫减敏疗法进一步被肯定1。变应原雾化吸入减敏疗法是改变减敏途径的新的免疫疗法, 李超乾等2在大鼠哮喘模型中成功进行了特异性变应原雾化吸入减敏, 并发现其与皮下减敏有着相类似的细胞、 分子机制, 提示该方法应用于临床的良好基础、 前提和可行性。T细胞是哮喘发病机制中的重要细胞。我们主要探讨特异性变应原雾化吸入减敏疗法对过敏性支气管哮喘的防治作用及与T细胞的关系。1  材料和方法1.1  材料  PEantihuman IL4、 PEantihuman IFN、 FITCantihuman TCR gamma delta及同型

8、对照均购自美国Ebioscience公司。Intraprep透膜剂、 PECY5antihuman CD45购自美国Backmancoulter公司。Ionnmycin、 Monensin、 PMA、 BFA为美国Sigma公司产品。阿罗格点刺液及阿罗格变应原购自德国默克·阿罗格制药有限公司。KCW1S型超声雾化器购自南通杰西电器有限责任公司。MasterScope肺功能检测仪购自德国耶格公司。流式细胞仪为美国Backmancoulter公司产品。1.2  方法1.2.1  实验分组  根据GINA哮喘诊断标准, 确诊为部分控制, 皮肤过敏原测试粉尘螨、

9、 屋尘螨阳性的门诊哮喘患者40例, 其中男23例, 女17例, 年龄1647(33.54±8.56)岁, 无心、 肝或肾疾患, 近期无感染史, 治疗前3个月未使用过激素和免疫调节剂。随机分为A（常规治疗组）、 B（吸入减敏组） 2组, 每组各20例。1.2.2  变应原的配制  在无菌条件下, 用力将浓度3级液摇匀, 吸取0.5 mL, 加入到装有4.5 mL溶媒的瓶子中, 摇匀, 稀释后立即写上“浓度2级”、 患者的姓名、 及稀释时间。以此类推, 分别配制“浓度1级”、 “浓度0级”、 “浓度1级”、 “浓度2级”、 “浓度3级”液, 于4保存备用。1.2.3&

10、#160; 基础治疗  评价患者临床综合指标, 填写支气管哮喘病情调查表及知情同意书。所有患者接受相同的基础治疗, 吸入替卡松/沙美特罗50/100 g（商品名: 舒利迭, 含氟替卡松和沙美特罗2种成分, 葛兰素史克公司）, 2次/d。按需吸入短效2受体激动剂（商品名: 喘乐宁, 每揿100 g, 葛兰素威康公司）两喷。1.2.4  分组治疗  A组雾化吸入生理盐水5 mL每周2次, 持续6个月。B组雾化吸入特异性变应原, 起始浓度以皮试强度而决定: 皮试强度+, 起始浓度1级; 皮试强度+, 起始浓度2级; 皮试强度>+, 起始浓度-3级。以起始浓度的第一

11、个最小剂量0.05 mL+5 mL生理盐水雾化吸入, 雾化结束后观察30 min。剂量依次递增为0.05、 0.1、 0.2、 0.4、 0.6和0.8 mL吸入6次后再提高一个浓度级进行雾化吸入。注意事项, 常规准备肾上腺素、 地塞米松、 平衡液等急救药品和物品。嘱患者做深慢呼吸, 吸气后屏气, 以助于雾化颗粒沉积于下气道和肺泡。严格遵循雾化吸入间隔时间, 如果吸入时发生气紧、 咳嗽、 咽痒等症状, 立即停止本次治疗, 下次脱敏变应原浓度降低。患者在治疗当天要避免体力活动（避免饮酒、 热水浴等）。1.2.5  诱导痰及痰标本的制作  用高渗盐水诱导痰, 其具体操作步骤采用

12、Pin改良法3, 收集足量痰液于刻度离心管, 用吸管去黏液、 唾液、 分泌物后, 加入4倍体积1 g/L的DTT(二硫苏糖醇), 用吸管轻轻吹打均匀, 37水浴15 min、 每隔5 min轻微搅拌1次形成细胞悬液, 用200目铜网过滤痰液以除去杂物, 以1200 r/min离心7 min, 离心弃上清后加入PBS液500 L, 余与下同。1.2.6  淋巴细胞的活化  取枸椽酸钠抗凝的外周血2 mL, 室温放置。取500 L抗凝血（痰标本）, 加入500 L含PMA（25L）、 Ionomycin (20L)、 BFA（20L）、 Monensin(1.7L)、 含胎牛血

13、清的RPMI1640培养液,混匀。37、 50 mL/L CO2培养箱培养4 h。1.2.7  诱导痰及外周血中T细胞占淋巴细胞百分比及IL4+、 IFN+T细胞占淋巴细胞百分比测定    将经淋巴细胞活化的外周血和诱导痰标本分A、 B、 C3管, 每管100 L, 均加入PECY5antihuman CD4510 L, A管加FITCIgG120 L, B、 C管加入FITCantihumanTCR 20 L、 室温暗处孵育20 min, 3管均加入Intraprep#1100 L、 室温暗处孵育15min后, 加入PBS液4mL, 1500 r/mi

14、n, 离心5min, 弃上清, 加入Intraprep#2100 L, 室温暗处孵育5 min, A管加入PEIgG110 L、 B、 C管分别加入PEantihumanIL4、 PEantihumanIFN各5 L, 室温暗处孵育20 min, 均加入PBS液4 mL, 1500 r/min, 离心5 min, 弃上清, 溶血机溶血（痰标本中加入PBS液500 L）。1.2.8  FCM检测  打开细胞仪及氩离子激光光源（488 nm）, 预热20 min, 仪器自动初始化, 用标准荧光微球进行光路与流路校准, 所有荧光信号的变异系数（CV）均<2%, 在侧向散射光(SS)为纵坐标, CD45PCY5为横坐标