叶绿素衍生物的合成及其应用研究进展

1、1 引言叶绿素(Chlorophyll是植物体内光合作用赖以进行的物质基础,广泛存在于高等植物的叶绿体中,是叶绿体中最为重要的一类光合色素。早在1818年,Pellatier首先从植物中萃取得到一种绿色色素并命名为叶绿素。1838年Berzelius报道了有关叶绿素的萃取方法。到1864年Stoke又发现叶绿素并非单体,而是绿色色素的混合物。但直到1906年,色谱法的发明者Tsvet才成功地从高等植物的叶绿体中分离出的叶绿素A和B。随后在1993年Willstatter成功地阐明了叶绿素的结构,他因此获得1915年度的诺贝尔化学奖。到了60年代,人们成功地人工合成叶绿素。叶绿素是一类含镁卟啉衍

2、生物的泛称,其中以叶绿素A和叶绿素B最为常见。叶绿素的分子中都含有一个卟啉环,Mg2+取代了环内二氢并与4个N原子配位形成相应的金属配体。除高等绿色植物叶绿体中含有比例3:1的叶绿素A和叶绿素B外,在多种藻类植物中还发现有叶绿素C类物质,包括叶绿素C1和C2两种成分。此外,在红藻中则发现叶绿素D的存在。 叶绿素A和叶绿素B是蓝绿色的蜡状晶体,呈深绿及墨绿色油状或糊状物,略带异臭,不溶于水,易溶于乙醇、乙醚、丙酮等有机溶剂。故常利用乳化剂制成具水分散性制剂。相对分子质量分别为893和907,其中叶绿素A的熔点为150153,叶绿素B的熔点为183185。天然叶绿素不稳定,对光和热敏感,易分解褪色

3、。在酸性条件下,叶绿素的卟啉环中心金属镁原子会被氢原子置换,生成暗绿色至绿褐色脱镁叶绿素。从化学性质上讲,叶绿素是一种双羧酸酯,叶绿酸的两个羟基分别被甲醇(CH3OH和叶绿醇(C20H38OH酯化。叶绿素a和叶绿素b的结构如图1,2。叶绿素a和b的分子中的镁离子易被铜、铁、钻等离子取代而成为叶绿素衍生物(chlorophyllin。现在市售是将铜置换中心金属镁后成叶绿素铜,再将其制成水溶性叶绿素铜钠,或用铁置成叶绿素铁,再制成水溶性叶绿素铁钠等钠盐。叶绿素铜钠和叶绿素铁钠为兰黑色墨绿色粉末,无臭或略带氨臭,溶于水,微溶于乙醇,氯仿,不溶于油脂。其耐光性比叶绿素强,在酸性溶液中因钠脱离呈水不溶性

4、。在存有钙,镁离子情况下会生成不溶性盐,所以,须注意用水水质,若用硬水,会有析出现象。(2叶绿素衍生物的种类及性质 叶绿素衍生物有叶绿素钠盐,叶绿素铁钠盐,叶绿素铜钾盐,叶绿素锌钠盐,叶绿素镁钠盐,叶绿素钾钠盐,叶绿素铜钾钠盐等,其对光,热,酸,碱的稳定性大大提高。其钠盐或铁钠盐又分为二钠盐和三钠盐。结构如图3。叶绿素的盐类衍生物为兰黑色至墨绿色的粉末,无臭或略带氨臭。 图3 叶绿素及其钠盐叶绿素铜钠为兰黑色一墨绿色粉末,无臭或略带氨臭,易溶于水,微溶于乙醇、氯仿,不溶油脂,耐光性比叶绿素强,在强酸性溶液中呈水不溶性,在体系中有Ca2+ , M g2+离子时会生成不溶性盐。叶绿素铜钠之所以较叶

5、绿素稳定是由于其符合下列条件:1离子结构方面:Cu2+为11一18电子构型的离子,为配位能力最强的形成体,可形成稳定的配位化合物;而M g2+为具有气体结构型的离子。2硬软酸碱原则(HSAB原则:路易斯将酸碱分为硬酸、软酸、交界酸和硬碱、软碱、交界碱各3类,而Cu2+为交界酸,叶琳结构中的吡咯为交界碱(吡咯可看作一个环状的亚胺,分子中存在一N一原子团,由于氮上未共用电子对参与杂环上其共扼体系,因而碱性与苯胺(交界碱相似,故可因软酸与软碱结合形成稳定配位化合物;而M g2+为硬酸不具备此条件3晶体场稳定化能: Cu2+离子在平面正方形场中的稳定化能无论在弱场或强场都较M g2+在四面体场的稳定化

6、能大. 叶绿素铜钠有与叶绿素类似的生理功能,如国外已将叶绿素铜作为保护胃壁药物销售,叶绿素铜钠则被认为对慢性荀麻疹、慢性湿疹、支气管哮喘有明显疗效,并对口臭的挥发性硫化物有抑制作用.FAO/W H O(1985规定,叶绿素铜钠的每人允许摄取量为0 m g/kg- 15 m g/kg,我国在食品中的最大允许添加量为0. 5 g/kg,其作为食品加工中的染色剂、脱臭剂已广泛用于口香糖、硬糖、果汁、汽水、配制酒、罐头、果蔬加工品、糕点等食品中.叶绿素铜钠一般可从蚕沙、松叶、竹叶或藻类中提取.据介绍,从竹叶中提取叶绿素在室内散射光照和< 100受热的条件下,有良好的耐受性,而在110以上较长时间

7、强热下稳定性明显下降,色泽变浅直至无色. 1 2叶绿素的合成制取叶绿素常以雏菊,苜蓿,小球藻或蚕粪等为原料,经丙酮等有机溶剂萃取可得以叶绿素a,b为主混合物,略呈异臭。但这种天然叶绿素遇热,光(特别是紫外线易分解,褪色,并对酸非常不稳定,遇酸时中心金属镁被氢置换脱离成暗绿至绿褐色脱镁叶绿素即叶绿素衍生物。为此常以铜,镁,钴等置换叶绿素中心金属镁,进行稳定化,如叶绿素加丙酮,甲醇后,再加氯化铜甲醇溶液加热搅拌,由铜置换中心金属镁得叶绿素铜,其耐光性佳,脱臭性强,加热流动性好,可作食用色素。但加酸铜被氢置换,成脱镁叶绿素。现以从竹叶中提取叶绿素为例:叶绿素提取工艺先将鲜竹叶捣碎,洗涤后过滤,滤渣用

8、6倍量的食用酒精浸溃,在反应釜中进行第一次提取,提取的时间为半小时。浸提后进行过滤,滤液用于提取叶绿素,滤渣用于进行第二次提取。第二次浸提亦用6倍量的食用酒精,滤液用于第一次浸提,滤渣用于第三次浸提,如此进行四次提取,其工艺流程如图1所示。利用减压蒸馏浓缩器在较低温度情况卜将酒精蒸出,一般温度以不超过45为宜。可得叶绿素含量大于13%的浸膏。此步如采取喷雾干燥,可得粉状产品。提取叶绿素后的滤渣中含有大量叶蛋白和矿物质等营养物质,可作为饲料原料直接使用。 3 叶绿素衍生物的合成及反应通常以Hanninen选择性水解法直接将蚕沙糊状叶绿素中的叶绿素a水解为脱镁叶绿一酸a,通过盐酸-乙醚分级分离而将

9、脱镁叶绿一酸a与糊状叶绿素中的其它组分分开。再用不同浓度的碱将脱镁叶绿一酸a水解成脱镁叶绿二酸a和脱镁叶绿三酸a。用这三种叶绿酸a衍生物做为合成叶绿素铁钠盐和叶绿素铜钠盐的结构单体,采用下列方法制备叶绿酸a铁(铜置换体。1. 叶绿酸a合成叶绿酸a铁钠盐在抗坏血酸存在下,将PH值控制在1-2, 60水浴置铁lh,铁酸经洗涤后成盐。2. 叶绿酸a合成叶绿酸a铜钠盐将反应液pH控制在2.5左右,60水浴置铜0.5h,铜酸经洗涤后成盐。研究比较这三种金属置换体的光谱数据,铁(铜络合量与结构的关系。结果表明,脱镁叶绿二酸a是三种衍生物中最适于制备金属置换体的结构,以该结构制备的铁钠盐,其吸收峰、特殊消光

10、值、消光比值基本符合日本食品卫生标准,铁络合量可达3.5%。以该结构制备的铜钠盐,铜络合量(总铜可达7.0%以上。经实验证明脱镁叶绿二酸a在无水乙醇中的波长-消光曲线,吸收峰为406nm和645nm。并确定了它是叶绿酸a中制备叶绿素金属置换体的最适结构。本实验中采用的制备叶绿酸a铁钠盐的方法比较稳定,可为生产提供一些参考。其中脱镁叶绿酸a 的结构和反应体系的pH值是影响铁络合量的关键因素,因而在制备铁钠盐的过程中,应将脱镁叶绿酸a结构控制为脱镁叶绿二酸a, pH值严格控制在1-2。铁结合量的高低应是决定光谱数据指标的决定因素。原理叶绿素主要存在于绿色植物中。现己有报道以竹叶、地椒草、二叶草、首

11、蓓叶、竺麻叶、羊蹄甲树叶,蚕砂等为原料.用溶剂萃取.经皂化与铜代来制备叶绿素铜钠盐。色素结构转变的机理如下: 工艺路线(一原料、浸取、过滤、浓缩、皂化、分离、调酸、铜代、过滤、成盐、干燥、成品原料经粉碎后,进行浸取,浸取常采用有机溶剂,并辅以搅拌.并维持恒温70左右。过程一般要持续3- 4h。有机溶剂可用丙酮,丁醇,一氯甲烷,乙醇,石油醚,异丙醇,三氯乙烯等。一般采用95%的乙醇溶液。浸取后.经过滤分离得墨绿色溶液.通常在皂化之前将浸取液浓缩。皂化是为了除去甲基和叶绿基酯基。向浓缩液中加入NaOH,在70左右搅拌约1h,冷却后用石油醚萃取,以除去叶黄素,胡萝卜素等杂质。分离出石油醚,皂化液用浓

12、盐酸调pH值至2-3.准备铜代。加入CuS04溶液,在70左右恒温搅拌一段时间,冷却,静置,然后抽滤得粗品。用蒸馏水,40%乙醇,石油醚各洗涤沉淀一次。用丙酮将沉淀溶解,滴加5% NaOH乙醇溶液至PH= 12,使叶绿素铜钠析出。抽滤,固体烘干得产品。特点:此法为一般的工艺方法,易实施。路线(二该路线与路线(一大致相同,只是在纯化阶段有所不同。此法主要采用酸化结晶的方法,即在得到粗品后,加入盐酸,并加入一定浓度和量的结晶诱导剂,搅拌,静置,抽滤后可得到叶绿素铜酸固体。然后使之溶于某一非极性溶剂中,缓缓加入某一极性溶剂,于45搅拌约20分钟,冷至25,静置50分钟,这是一个反萃结晶过程。抽滤,即

13、可得到精制的叶绿素铜酸。然后再制备叶绿素铜钠盐.。纯化流程如下:铜代液、加盐酸、加结晶诱导剂、抽滤、溶解、反萃结晶、士由滤、精制品特点:此法主要是将产物以叶绿素铜酸(固体结晶的方式从铜代液中析出,使产物析出完全,杂质少,但溶剂消耗大。路线(三在浸取阶段采用了色谱分离法,即将原料浸泡后,使用一个层析用玻管。用少许脱脂棉填于底部。将浸液移入管中,使绿色渗辘液从管底流出,同时补充乙醇。待渗出液绿色己很浅时,可停止渗辘。此法的其它工艺阶段与路线(一一致。特点:这种方法速度慢,.耗时长,但得到的提取液的纯度很高。路线(四在浸取后,先进行酸化置铜,然后皂化,此时己有叶绿素铜盐产生。在回收部分乙醇后,用石油

14、醚萃取滤液,除去杂质,接着用浓盐酸调节pH= 2- 3,再加入蒸馏水,静置后,铜酸固体浮起。分别用水和乙醇洗涤铜酸,而后抽干。在净化后的铜酸中加入NaOH 溶液,抽干,烘干得产品。特点:此法先铜代后皂化有利于叶绿素稳定性的增强,对工艺的温度要求不苛刻,可节省大量有机溶剂,产品纯度较高。3.1.1氯化血_红素和叶绿素是生命中的主要物质,它们均为四吡咯金属配合物,在一定条件卜可相互转化成各系列的衍生物,在补血_剂、光增感剂和分子机能材料等方而有着重要的应用。但日前许多研究工作主要以叶绿素为原料,采用半合成方法制备叶绿素衍生物。本文以叶绿素为原料,在合成甲基原焦脱镁叶绿酸a的基础上,进一步合成具有血

15、红素核心结构的卟啉衍生物原脱镁叶绿酸a甲基酯,为半合成其它卟啉类衍生物提供基础。蚕沙粗品叶绿素a(200g溶少乙醚(500ml.加入36%盐酸( 500m1. 于0。暗处搅拌30min,静置,分取下层酸液,用N a0H( 10mol/ 1中和至ph= 45,过滤,干燥,得脱镁叶绿酸a粗品。薄层色谱检测三氯甲烷-丙酮-甲酸(70:29: 1展开,呈3个主要斑点。经硅胶柱色谱分离,收集第一谱带洗脱液,减压浓缩。用四氢吠喃/正己烷重结晶得脱镁叶绿酸a结晶(图2。将以上固体溶于乙醚.在冰盐浴上加入过量新配制的CH2N2/乙醚溶液.反应5min,滴加醋酸除去过量的CH2N2,饱和NaCI溶液,洗后用Na

16、2S04干燥.浓缩至干。硅胶柱色谱分离得绿黑色脱镁叶绿酸a甲基酯。 3.1.1.2 锌脱镁叶绿酸a甲基酯的制备:脱镁叶绿酸a甲基酯(100mg, 0. 185mol溶于CH2Cl2(100m1.加入20m1,饱和醋酸锌/甲醇溶液.室温下通氮气搅拌2h。TlC检测.展开剂为丙酮/一氯甲烷( 15: 85 ,当黑色斑点消失.同时在稍下位置形成另一个绿色斑点。则加水1000m1,过滤。用二氯甲烷/己烷重结晶,得到绿黑色固体锌甲基脱镁叶绿酸a。3.1.1.3 锌原脱镁叶绿酸a甲基醋的制备:锌脱镁叶绿酸a甲基酯( 50mg, 0.071mol溶解于重新蒸馏过的丙酮(50mL中。加入溶解有DDQ(16mg

17、, 0.071mol的无水丙酮溶液(40m1,.通氮气,室温搅拌。反应混合物由蓝绿色变为棕红色。UV Vis检测.当叶绿素衍生物的特征656nm的吸收峰消失后.用二氯甲烷抽提完全。依次用KOH溶液、H20洗涤.用Na2S04干燥有机相,浓缩至干。得到具有卟啉结构的红色锌脱镁叶绿酸a甲基酯。以叶绿素一a (1为起始原料,在含有氢氧化钠的正丙醇溶液中,通入空气流进行氧化再经酸性脱金属镁离子和甲基化,分别得到紫红素一7三甲醋(2和紫红素一18酯a (3;改变反应条件,将1溶解于含有5%硫酸甲醇溶液中回流,通过脱镁、酯交换和空气氧化反应,形成一对(S一和(R-132-轻基脱镁叶绿一a甲酯的异构体4a和

18、4b.在含有5%硫酸甲醇溶液中室温搅拌12 h,叶绿素一a则转化为脱镁叶绿素一a甲酯(MPa (5,在浓盐酸中氯化氢对3一位双键发生加成反应,随之得到其水解产物叶吩醇(6,碱性条件的空气氧化使得6的E一环发生氧化和重排,最后形成紫红素一18衍生物7 (Scheme 1.(33-位苯并含氮杂环取代的焦脱镁叶绿酸-a甲酯的合成 3.3 3-位苯并丫啶取代的焦脱镁叶绿酸-a甲酯的合成以焦脱镁叶绿酸-a甲酯(MPP-a为起始原料在二氯甲烷中与醋酸锌共回流得锌配合物在四氯钯锂催化下通过与苯基氯化汞的偶联反应生成3-苯基焦脱镁叶绿酸-a甲酯分别选用四氧化饿、高钉酸四丙基铵(TPAP和N-甲基吗琳N-氧化物

19、将环外烯键氧化成邻二酮'在酸性条件下4与邻苯二胺的缩合形成了2-位喳喔啉取代的焦脱镁叶绿酸-a甲酯用四氧化饿和高碘酸钠将1的3位碳碳双键氧化,则生成焦脱镁叶绿酸-d甲酯所得卟吩醛与环己二酮和萘胺进行一锅法反应,得到3-位苯并丫啶取代的焦脱镁叶绿酸-a甲酯 3.4 酸碱条件下脱镁叶绿酶 a 甲酯的空气氧化反应将叶绿素-a l 溶解于乙醚中,加入含有氢氧化钠的正丙醇溶液,通入空气进行氧化,再经酸性去镁离子和甲基化得紫红素-18酯3;改变反应条件,将叶绿素-a l溶于5%硫酸甲醇溶液中回流,在完成脱镁和酯交换反应的同时经空气氧化生成(S一和(R一13-羟基脱镁叶结a甲酯异构体4a和4b. 叶

20、绿素铜钠盐6. 8g,糖精钠0. 3g,甘油4. 5m1.吐温-80 3. 5m1, CMC-Na 2g一西黄筮胶5g,蒸馏水100m1。杨继生等以蚕砂为原料,.经预处理、浸提、过滤、分离得墨绿色溶液,浓缩后得叶绿素浓缩液。向上述浓缩液中加入氢氧化钠.在70左右搅拌约1h.冷却后用石油醚萃取。分离出石油醚.皂化液用浓盐酸调PH值2 3.加入硫酸铜溶液。在70左右恒温搅拌20min,冷却,静置.然后抽滤得粗品,经用蒸馏水、40%乙醇、石油醚洗涤沉淀。将沉淀用丙酮溶解。滴加5 %氢氧化钠乙醇溶液至PH 12。使叶绿素铜钠盐析出.抽滤.固体烘干得叶绿素铜钠盐。取CMC'-Na加水50m1,西

21、黄筮胶加水40m1.分别制成胶浆。糖精钠溶于l0ml热蒸馏水中,加入西黄筮胶胶浆中混匀为甲液;将叶绿素铜钠盐在乳钵中研磨成细粉后。加入吐温-80、甘油及CMC'-Na胶浆.逐一研匀为乙液,将甲液加到乙液中研匀,除泡后倾入一面涂有润滑剂的2块玻璃板上铺匀。自然干燥24h,脱膜,切成8. 5 X 1. 5cm条,紫外线消毒30min,置干燥瓶中备用。4 叶绿素的生理功能叶绿素是光合作用的物质基础,是自然界中将光能转变为化学能的纽带,它对地球上的生命物质具有极为重要的意义。叶绿素在化学结构也与人类和大多数动物的血红素极其相似。有关叶绿素的生理功能早在1919年就已提出,当时的报道认为叶绿素具

22、有促进增血功能和加速治愈创伤的作用。在二次世界大战中,美国曾将叶绿素和青霉素并用来治疗伤员,不仅节约了一半以上当时价格昂贵的青霉素用量,而且取得了积极的效果。此后进行的大量研究表明,叶绿素还有多种生理功能。4.1 抗突变叶绿素、叶绿酸具有强烈的抑制突变作用,可以钝化致突物质的活性,其中尤以叶绿酸对致突变物质的抑制作用最强。叶绿素、叶绿酸可以与致癌物质Trp-p-2活性形成复合物,降低其活性,而且还能抑制致突变性物质的代谢,促进机体的解毒代谢,阻碍突变性物质的生物合成。叶绿素具有抑制黄曲霉素B1、苯并芘等强致癌物的致突变作用。而植物绿质钠也有消除肝腹水、抑制肝癌细胞增殖的抗肿瘤功效。此外,叶绿素

23、铁对过氧化酶的活性也有抑制作用。4.2 促进伤口愈合叶绿素可促进刀伤、烧伤、溃疡等伤口肉芽新生,加速伤口痊愈。对创伤和溃疡采用局部叶绿素涂搽,可干燥创伤面,加速肉芽和上皮细胞的新生,明显促进伤口的愈合。日本久保的试验结果也表明,对大鼠幽门结扎引起的溃疡以叶绿酸剂与抗胆碱药同时使用时,可明显增强后者的抗溃疡作用。叶绿素铜还具有保护胃壁和抗胃蛋白酶的作用,每日摄取90mg无任何副作用,许多国家现已将叶绿素铜作为药物使用。Smith等发现水溶性叶绿素衍生物可加速动物实验性创伤和烧伤的愈合。在临床试验中与青霉素、磺胺等药物比较,叶绿素治愈创伤的作用最强,速度亦最快。Comhe,用水溶性叶绿素衍生物治疗

24、皮肤病及皮肤创伤患者。结果表明,叶绿素溶液及软膏能促进肉芽组织及上皮组织的生长。局部应用时,叶绿酸钠可通过活化成纤维细胞,促进胶原纤维生长,最终加速创伤的上皮形成,加速小鼠和豚鼠实验性皮肤创伤的治愈。同时,叶绿酸钠可促进局部血管扩张,改善创伤部位血液循环,对各种慢性溃疡(如醋酸演疡、可的松溃疡等和急性溃疡(如幽门结扎演疡都有抑制作用。铜叶绿酸钠与甲苯乃嗓、消化性粘蛋白或某些单用并无抑制溃疡作用的药物(如阿托品、甘草根提取物等合并应用有抗溃疡协同作用。锌叶绿酸a也是另一种很有希望的药物。该药对20例烧伤患者进行曝露疗法治疗,无1例感染,用此药治疗烧伤具有创面渗出液少、结痴快等优点,将其用来治疗一

25、般溃疡、口腔溃疡、唇炎、疤疹等均收到较好的疗效。锌叶绿酸a也可作补锌剂,并优于其它补锌剂,其味甜,也可作静脉注射。水溶性叶绿素衍生物抗溃疡作用的机理尚不清楚。除了与其促进损伤组织愈合有关外,还可能与其抑制某些消化酶的活性有关。实验证明,叶绿酸的铜、铁络合物对脂蛋白酶活性、叶绿素及叶绿酸对麦芽a一淀粉酶活性、二氢叶吩对胰脂酶活性以及二氢叶吩e6对脂酶、胃蛋白酶及a一淀粉酶活性均有抑制作用。有关叶绿素的脱臭作用早在二次世界大战时就已被发现。当时患有某些疾病的患者在使用叶绿素后,散发恶臭的现象马上消失。叶绿色素对脚臭、腋臭以及由膳食、抽烟或新陈代谢异常产生的口臭等有良好的除臭作用。叶绿素还可以消除人

26、体因摄入酒精后呼气中的口臭,但不能降低呼气和血液中的酒精浓度。有人认为叶绿素的脱臭作用部分是其抑制机体代谢过程中的硫化物的产生的结果。叶绿素及其脱镁产物脱镁叶绿素、脱镁叶绿酸还具有降低血浆胆固醇的作用。一般来说,叶绿素的降胆醇作用随配位金属的不同而异,其中具有降胆固醇作用最单纯的叶绿素单元结构的植物绿质。此外,叶绿素还能轻度促进肠道蠕动,具有缓解便秘的功能。4.6抗诱变作用(治疗癌症Lai于1979年首先提出叶绿素有抗诱变作用他开始观察到麦芽的提取物能抑制苯并(a花B(aP引起的诱变作用,接着发现叶绿素是这种抗诱变的主要成分。叶绿素的水溶性代谢产物叶绿酸也有相同的抗诱变作用。目前,有关叶绿素抗

27、诱变作用的研究多采用A-me。试验,并已获得了比较肯定和一致的结果。叶绿酸铜钠对几种已知诱变剂和致癌物质如苯并(a花,N一甲基亚硝基脉等以及氨基酸热解产物的致突变活性有抑制作用。此外,它还能抑制许多日常生活环境和膳食中经常接触的复杂混合物,如炸牛肉、炸羊肉的提取物、红葡萄汁、红葡萄酒、香烟烟雾、鼻烟、咀嚼烟、尘埃、煤尘、柴油引擎排出尘粒等的诱变作用。在哺乳动物体内试验中直接证明叶绿素抗诱变作用的报道较少。Abraham等曾发现给小鼠注射环磷酞胺后,立即用富含叶绿素的菠菜汁灌胃,环磷酞胺诱发的骨髓细胞微核受抑制,抑制率约50%。把环磷酞胺溶于菠菜汁中灌胃后,菜汁对环磷酞胺诱发的微核同样具有抑制作

28、用。在睾丸染色体畸变试验中,豌豆叶绿素对环磷酞胺诱导的小鼠精母细胞染色体畸变有抑制作用。祝慧娟等研究设计的3种不同程度实验中,小鼠给予叶绿酸铜钠0.8,2. 0 ,5. Omg/kg对环磷酞胺诱导嗜多染红细胞的微核发生率均有明显的抑制作用。 Renner利用中国仓鼠研究了叶绿酸对强诱变剂唾替娠所致染色体畸变的抑制作用,结果表明叶绿素对断裂效应的抑制率为70%一85%,且有明显的剂量反应关系关于叶绿素衍生物的抗诱变机制,迄今仍不十分明确。目前,一般认为其作用机制可能涉及:抗氧化和自由基清除作用;直接与诱变剂形成复合物抑制其诱变作用;影响与诱变物代谢有关的酶活性,从而促进诱变物及代谢产物的降解与排

29、泄;光还原作用和光动力作用。血液色素和绿色植物色素间的化学关系的建立,是叶绿素药理学应用的最早研究。瑞士伯尔尼大学药理学研究所主任Burgi博士最早通过动物及临床试验证明叶绿素及其衍生物对贫血的治疗作用。Burgi用一种叶绿索一铁化合物治疗了126例贫血病人,所有病例不仅在血象方面疗效显著,而且病人食欲增加,同时病人的一般状况都表明治疗效果明显。Aoki等在20世纪30年代已证明,叶绿素能被机体用来促进血红蛋白的再生。Izotova报道,从叶绿素制得的含铁化合物如叶绿素铁、铁二氢叶吩e6三羧酸以及叶绿酸铁钠能有效地治疗软毛动物的贫血。铁叶绿酸钠能明显提高正常小鼠粒单组细胞(CFU一GM和红系组

30、细胞(CFU一E增殖分化能力及外周血网织红细胞比例,提示有刺激骨髓造血作用,它还能减轻乙酞苯肼致溶血性贫血小鼠外周血红细胞和血红蛋白降低的程度,失血性贫血大鼠经SIC治疗,能明显升高外周血红细胞和血红蛋白以及降低网织红细胞比例.并提高血清铁水平和转铁蛋白饱和度,表示它对动物实验性贫血有良好的疗效。叶绿酸铜钠盐不仅能提升60Co。辐射小鼠的周围血象中红细胞、血红蛋白、白细胞、血小板等指标,且对辐射小鼠骨髓中多能干细胞(CFU一S,粒单组细胞、红系组细胞及骨髓有核细胞的恢复有明显的促进作用,对骨髓基质细胞的修复也有一定的调节作用;对再生障碍性贫血的临床有效率达到80%。某些二氢叶吩衍生物的铁、钻、

31、锰等络合物对化学物质及辐射引起的白细胞减少症具有明显的预防和治疗作用。叶绿酸铁对由对苯二磷酸亚乙基乙酞亚胺引起的白细胞减少有预防作用。张广明等合成了一系列不同的二氢叶吩金属络合物,并在实验模型上初步证明了其对辐射引起的再生障碍性贫血的治疗作用。结果表明,它们不仅能明显延长实验动物的平均存活时间和平均存活数,还能增高实验鼠的白细胞计数,并明显促进造血干细胞向红系的转化。其中二氢叶吩e。单甲醋铜络合物的作用最强。赵堂富魏克民等人在小鼠的实验中表明,叶绿酸铜钠对小鼠骨髓中多能干细胞(CFU一s、粒单袒细胞(CF U一GM、红系袒细胞(CF U一助及骨髓有核细胞的康复有明显的促进作用,对骨髓基质细胞的

32、修复也有一定的调节作用。故可以考虑用它来治疗白细胞减少。魏克民等11>人用肝血宝预防放疗、化疗导致的白细胞减少,并与鳖肝醇进行对照。治疗组30例,予肝血宝片2片(每片含叶绿酸铜钠20 mg每日3次,对照组18例,予鳖肝醇50 mg每日3次,以30天为一疗程。疗效分为3度:显效(白细胞总数及中性粒细胞总数升高者;有效(二者绝对值维持不降或WBC> 4000 x 109;无效(WBC<4000 x 10',中性粒细胞绝对计数较治疗前减少。结果治疗组显效20例(66 .7 %,有效9例(3 0 %,无效1例,总有效率为%.7;对照组有效8例(44.4 %,无效10例(55

33、.6 %,总有效率为44.4,初步结果表明肝血宝的疗效较鳖肝醇好。在不同病因的白细胞减少中,以化学药物及放射线照射所致者疗效最好。作者未报道其差异的统计学意义。在进一步的临床研究12中,北京医科大学附属人民医院、哈尔滨医科大学附属二院等15个临床单位将361例各种原因引起的白细胞减少证患者,随机分为肝血宝组265例、安慰剂双盲对照组46例以及维生素B4 .鳖肝醇、脱氧核普酸钠三药联用的西药对照组50例。结果肝血宝组显效164例,有效71例,无效30例,总有效率为88 .68%;安慰剂双盲对照组的总有效率为19.6%,两组疗效对比有非常显著的差异(P < 0 .001;西药对照组总有效率为

34、42%,两组对比也有显著差异(P 0.01。肝血宝组265例患者中,治疗结束时白细胞总数的水平较治疗前有明显提高,其中58例提高100%以上,有93例提高50%一100;有73例提高30 % - 50,只有41例提高在30%以下。治疗后白细胞总数、由低于3000/ m m'上升至大于4000/ m m2者共有158例;肝血宝组患者在治疗后白细胞总数,嗜中性粒细胞绝对值血红蛋白含量、血小板计数、网织红细胞计数的平均值较治疗前均有明显升高,经统计学处理有显著差异,说明肝血宝对血象三系均有不同程度的升高作用。与安慰剂对照组治疗后,患者的血象三系细胞上升情况对比,经统计学处理两者有非常显著的差

35、异(p<0 .001或P 0.01;与西药对照组对比也有显著差异。治疗后患者头晕目眩、耳鸣无力、心悸气促、鼻蛆,龈血、疲斑等症状改善明显。对肝血宝组对45例患者停药6一17个月后随访,结果白细胞总数仍保持在治疗结束时的水平以上者43例,只有2例较治疗结束时下降。临床试验证明,肝血宝疗效不因疗程延长而提高,其中以一疗程疗效为最高。在各种原因引起的白细胞减少症中,肝血宝对原因不明性白细胞减少症疗效最为理想,病程短者疗效均好,病程长者则疗效均差,治疗后,患者主要表现为白细胞总数及嗜中性粒细胞绝对值上升。肝血宝显效时间较快,一般在用药后7一10d见效,停药后疗效也较稳定,能使患者自觉症状改善,食

36、欲增加、体力恢复。故初步认为,肝血宝疗效优于目前临床上常用的升白细胞药物如维生素B4 .鳖肝醇、脱氧核普酸钠、利血生等。方国全等人用叶绿酸铜钠40 mg每日3次治疗30例因放疗、化疗、感染、药物等原因引起的白细胞减少,并与利血生、鳖肝醇对照,发现叶绿酸铜钠组治疗1月后,WBC.NBC .PLT有不同程度的升高,其差异有统计学意义(P < 0 .05。且总有效率高于对照组,两者之间的差异具有统计学意义,其中对放、化疗组及药物组的疗效更明显,作者认为在1个月的治疗中对Hb的影响尚不明显。不过,作者观察的例数较少,平均每一组仅6一9人。其疗效有待进一步验证。以上的几个实验表明,对于各种原因所致

37、的白细胞减少,叶绿素铜钠具有相当的疗效,值得进一步研究运用。但对于具体原因所致的白细胞减少的疗效,各家报道不一。可能与各自的样本含量相差太大有关。如要切实了解它对某种病因所致的白细胞减少的疗效,最好能进行多中心、大样本、符合随机对照盲法要求的临床实验。目前,对叶绿素衍生物治疗贫血及白细胞减少的机理尚不清楚,除刺激骨髓造血解除有害物质对骨髓的抑制外,其中所含的金属离子可能有较重要的意义。研究表明,不论是叶绿酸铜钠本身,还是它的进一步降解产物都有较强的抗溃疡活性。苏桂兰等人以叶绿酸铜钠0.1g每日3次给药以治疗经胃镜证实的消化性溃疡70例。对照组63例予甲氰咪肌0 .2g每日3次;结果表明二者疗效

38、无明显差异。姚建忠等人将蚕砂叶绿素粗品经吡啶回流降解、醋酸锌络合后制得锌二氢叶吩e4。在小鼠实验中,以100 mg/ kg ip ,30 min后予消炎痛20 mg/ kg ip,并同西米替丁100 mg/ kg ip和0.9%NS.0.5 %CMC 进行对照。结果表明二氢叶吩e4对消炎痛诱发的胃溃疡个数和胃溃疡指数有明显的抑制作用(p0.01,但和西米替丁之间的差异无统计学意义。沈卫镝等人以蚕沙糊状叶绿素为原料,经脱镁、扩环制得铜紫红素一18;实验表明它能显著降低小鼠TAA实验性肝损伤模型的SGPT活性和大鼠应激性胃溃疡指数,其疗效与叶绿酸铜钠相当,但性质更加稳定;并认为它是叶绿酸铜钠的主要

39、成分和主要活性成分。进一步研究表明,铜紫红素一18进一步降解、络合制得二氢叶吩P6一6一(N一乙基酞胺_ 7,r一二甲酯锌具有较好的抗溃疡作用,能显著降低吲哚美辛诱发的大鼠溃疡指数和溃疡个数,其作用强度与西米替丁相当。以上的研究可以初步表明,叶绿酸铜钠及其衍生牧具有一定的抗溃疡活性,但其作用机制是什么,作用强度有多大,尚需要进一步的研究。胃溃疡的一个严重并发症就是恶变,结合叶绿素的抗诱变活性,叶绿素及其衍生物在胃溃疡的治疗中有望起到较重要的作用,值得进一步研究。有关叶绿酸铜钠抗肝损伤的报道始于1951年,Mc-Closkey等在CCl4、所致大鼠肝损伤模型中,证实叶绿酸铜钠可以减轻肝损伤程度。

40、在90年代初期,祝兰卿等人观察了叶绿酸铜钠对硫代乙酞胺、醋氨酚. CC14、所致小鼠急性肝损伤的保护及治疗作用。在硫代乙酞胺模型中,自染毒前7d开始,分两组分别以25 mg/ kg和50 mg/kg ip每日1次,共10次,予硫代乙酞乙酞胺50 mg/ kg染毒,染毒后72h取血送检。治疗实验以硫代胺30 mg/ kg ip染毒,于染毒后2h及8h后分别以50 mg/kg及100 mg/ kg ip,结果表明预先服用叶绿酸铜钠可阻抑小鼠因硫代乙酞胺急性中毒所致SGPT和SGOT活性升高,其中50 mg/ (kg。d x10d组降低酶活性的作用显著或非常显著(P X0.05或P X0.01。在治

41、疗实验中,两种剂量均可以降低SGPT的活性,且与模型组相比有高度统计学意义(P X0.01,但对SGOT的影响不具有统计学意义。在醋氨酚模型中,自染毒前7天开始,以叶绿酸铜钠50 mg/ kg ip qd,共10天,以醋氨酚150 mg/ kgip染毒,染毒72h后取血送检。结果表明,SGPT活性治疗组、空白对照组与模型组相比P 0.01;而SGOT活性则分别有P 0.01 , P0.05,表明用叶绿酸铜钠进行预处理对醋氨酚所致的肝损伤有保护作用。在CC14模型中,将SGPTSGOT正常的大鼠随机分组,分别以叶绿酸铜钠50 mg/ kg及生理盐水ip每日1次,共14天,第8天以CC14 5 m

42、l/ kg sc染毒,于第11 .13 .1 5天取血送检。实验结果表明,在染毒后24h以内叶绿酸铜钠不能阻抑CCl、引起的转氨酶升高(>正常值10倍以上。仅从染毒后72h起使已升高的酶活性显著降低,并加速恢复过程。在CC1、所致的慢性肝损伤模型中,在造模成功后(约需9周左右,予叶绿酸铜钠治疗3周,其SGOP显著下降(P X0.01 ;SGPT活性虽然治疗前升高不明显,但治疗前后也有统计学差异(P < 0 .05目前,医学界对叶绿素及其衍生物的研究正日渐深入,并由此合成了很多新的化合物。从目前的研究结果来看许多化合物具有较好的运用前景。而叶绿素作为一种在自然界广泛存在的物质,其原料

43、丰富,制作简便。对国内而言,目前,叶绿素衍生物主要是从中药蚕沙、竹叶等药物中提取。由于有丰富的蚕桑资源,制备尤为方便。故有必要对叶绿素类物质进行更深入的研究和利用。但也应当指出的是目前对它的研究还欠深入,很多研究都还比较粗糙,对其活性成分、作用机理都还不清楚。且目前的研究大多为动物实验;大样本、多中心、符合随机双盲对照原则的临床实验较少,有待进一步的深入。5 叶绿素衍生物的生物活性研究进展光动力疗法(photodynamic therapy, PDT始于20世纪70年代,经过了30年来的大量基础和临床研究,现已发展成为肿瘤的法定疗法之一。这一肿瘤新疗法的日趋成熟使光动力治庙新药研究进人了一个飞

44、速发展的新时期。目前光动力治癌药物的发展重点为中介取代芳基叶吩、叶绿素降解衍生物、水溶性金属酞普和苯并叶琳等单体化合物3。叶绿素降解产物及其衍生物具有明确的化学结构,且在600 -700nm波长处吸收系数较高,光敏作用强,毒性低,是一类极具发展前途的潜在光动力治疗药物。该类衍生物包括脱镁叶绿酸。、二氢叶吩e6、紫红素一18和二氢叶吩P6及其各自的衍生物。目前,国外报道较多的二氢外吩e6衍生物HPes已经美国FDA批准进人二期临床试验。它的吸收峰为664nm,烟台大学毕业论文（设计） 分子吸光系数为光敏素(photofrin 的 10 倍，应用 2 -4h 后，在肿瘤内的聚集达到高峰， 水溶性使

45、它可从尿中排泄，日光过敏反应弱，有希望进行 PDT 的临床治疗。二氢叶吩 e6 三 甲酯己醚在 1 mg/kg 时即对肿瘤产生抑制作用。近期，姚建忠等 一 对二氢叶吩 ee、二氢叶吩 f、二氢叶吩 f 甲醚及二氢叶吩 Pe 酞胺衍生物的肿瘤光生物活 性作了深入研究，药理试验结果表明，不同二氢叶吩衍生物的光敏化力、对体外人庙细胞 光灭活作用和动物移植瘤的光动力疗效均明显高于血叶琳衍生物(HpD。另外，紫红素的 衍生物 Tinetiopurpurin ( SnET2 的激发光波长为 664nm，在国外已进人了 I/II 期临床 试验。Kaplan 等人用 SnET2 几作为光敏剂进行了转移性皮肤癌

46、的 PDT 治疗，临床效果较好 5.2 抗氧化作用 将叶绿素及其衍生物作为一种抗氧化剂，日本学者 Sato 曾作过比较深人的研究。体 外实验结果表明，叶绿素借助于抑制脂质过氧化作用和抑制溶酶体释放来保护溶酶体膜免 受过氧化损伤。 将叶绿素或其衍生物注入动物腹腔， 发现它们分布于肝亚细胞器如线粒体、 微粒体和溶酶体内，发挥抗氧化作用而抑制脂质膜的氧化损伤，并能有效地防止抗坏血酸 诱导脂质过氧化所造成的肝微粒体功能损害，抑制在低渗葡萄糖介质中孵育所致酸性磷酸 酪酶和芳基硫酸醋酶从溶醉体中的释放。由于人体肝脏、肾脏等器官损伤的一系列病变均 与体内脂质的过氧化作用有关，因此叶绿素衍生物被广泛应用于器官

47、损伤的保护。原叶琳 和一种组成复杂的二氢叶吩铜络合物的混合物铜叶绿酸钠对肝脏有保护作用。铜叶绿酸钠 在体内可明显减轻四抓化碳引起的肝脏损伤。预先用铜叶绿酸钠也可明显抑制四抓化碳引 起的血浆谷草转氨酶(AST 、谷丙转氨酶(ALT和异拘株酸脱氢酶浓度(肝脏坏死指标的 升高、肝脏甘油三醋的增加(肝损伤特点以及肝脏色氨酸毗咯酶活性下降(四抓化碳致蛋 白质合成障碍的指标 191。此外，铜叶绿酸钠对硫代乙酞胺、醋氨酚和四氯化碳所致急 性肝损伤具有良好的保护作用.对四抓化碳所致大鼠慢性肝损伤亦有较好的治疗作用。由 蚕砂制备的铁叶绿酸钠在预防性给药时对 D 一 Ga1N 致急性肝损伤引起的 AST,ALT

48、活性增 高有显著抑制作用，对四抓化碳引起 ALT、总胆红素增高亦有显著抑制作用，而且对 D 一 Ga1N 急性肝中毒后立即给药， 也有良好的治疗作用， 可保护肝脏， 促进和加速肝功能恢复。 应用铁紫红素 7 治疗肾脏缺血再灌注损伤，结果显示，治疗组肾组织匀浆中 MDA 及血清中 LDH 的水平均显著降低，病理症状也有所减轻。 抗菌、 5.3 抗菌、抗病毒作用 Smith 观察到水溶性叶绿素衍生物对葡萄球菌、链球菌及厌氧产泡子菌有抑制作用。 Koser 和 Nevin 等证明铜叶绿酸钠能抑制葡萄球菌、链球菌和乳酸杆菌的生长。Mowbray 和 E1 一 Nakeeb 等发现叶绿酸铜钠对革兰阳性菌

49、有抑制作用，1%浓度的叶绿酸铜钠对其生 长抑制率达 98,818%一 99.999%。但叶绿酸铜钠对革兰阴性菌的抑制作用则不一致。 Klebsiella aerogene。和革兰阳性菌一样对叶绿酸铜钠敏感，生长抑制率高达 99.982%; 而绿脓杆菌的生长则不受叶绿酸铜钠的影响;灵杆菌、普通变形杆菌及大肠杆菌的生长仅 部分受叶绿酸铜钠抑制。二氢叶吩衍生物是一类光敏抗菌物质，其抗菌谱与 Mowbray 和 E1 一 Nakeeb 等报道的类似，但其抗菌活性与光照强度有关，光敏抗菌作用与单线态氧存在 有关。二氢叶吩衍生物还具有抗病毒作用。将镁叶绿酸钠加至亚洲型流感病毒 101 株或牛 痘病毒悬液中，3min 后，部分毒体膜即遭破坏;30min 后，核酸也遭到破坏。将叶