模拟缺血再灌注诱导人离体胃黏膜上皮细胞的凋亡

1、模拟缺血/再灌注诱导人离体胃黏膜上皮细胞的凋亡         10-10-29 11:33:00     编辑：studa20                  作者：石玥，乔伟丽，王光明，吴金霞，闫长栋，张建福【摘要】  目的 模拟缺血/再灌注诱导人离体的胃黏膜上皮细胞损伤模型，观察再灌注不同时

2、间点胃黏膜上皮细胞凋亡情况并分析其规律。方法 采用人胃黏膜上皮细胞株进行体外培养并传代，细胞以缺氧(5% CO2、1% O2、94% N2)+无糖KR液模拟缺血、缺氧，复氧、复糖模拟再灌注诱导胃黏膜上皮细胞凋亡，用流式细胞仪、Hoechst33258染色法观察正常对照组及模拟损伤组于模拟缺血1 h，再灌注3、6、12 h细胞凋亡的情况及变化规律。结果 胃黏膜上皮细胞1224 h贴壁，24 h后有少量上皮样细胞从周边爬出，48 h后细胞呈指数样生长，72 h后细胞已基本能达到融合。模拟胃缺血/再灌注后细胞凋亡率于缺血1 h、再灌注6 h时出现高峰，且与正常对照组相比差异有统计学意义(P<0

3、.01)。经Hoechst33258染色，荧光显微镜下观察可见细胞于缺血1 h、再灌注6 h时产生典型的凋亡形态学变化如核浓染、核碎裂、边集等。结论 成功模拟了缺血/再灌注诱导人离体的胃黏膜上皮细胞损伤模型;该损伤模型可引起胃黏膜上皮细胞的凋亡，且在缺血1 h、再灌注6 h时为高峰。 【关键词】  胃缺血/再灌注;胃黏膜上皮细胞;细胞凋亡;细胞培养Abstract: Objective To simulate the ischemia/reperfusion-induced injury to the epithelial cells of gastric mucosa and to

4、 investigate the cellular apoptosis at different time points in order to explore its regularity.Methods Human gastric epithelial cell line was cultured and subculture in vitro. The cells were subjected to hypoxia (5% CO2, 1% O2 and 94% N2) + glucose-free KR bicarbonate buffer and succedent reperfusi

5、on (5%CO2 and 95% air) in DMEM/F12 to simulate conditions of ischemia and hypoxia, reoxygenation and glucose reintroduction. The morphological changes and the percentage of apoptotic cells were evaluated by Hoechast33258 staining, flow cytometry (FCM) at reperfusive 3, 6 and 12 h secondary to 1 h si

6、mulated ischemia culture.Results Observation under the inverted microscope revealed the gastric mucosa epithelial cell adherence after 12 to 24 h; and at 24th h, there was outgrowth of epithelial cells; at 48th h the cells were in exponential growth; and at 72nd h the cultured cells reached nearly c

7、onfluence, displaying the typical cobblestone appearance. FCM analysis revealed that the percentage of cell apoptosis peaked at simulated ischemic 1 h and reperfusive 6 h, with significant difference (P<0.01) compared with control group. Hoechst33258 staining and fluorescent microscopy revealed t

8、ypical morphological changes of apoptotic cells including hyperchromatic nuclei, karyorrhexis, margination, etc. at ischemic 1 h and reperfusive 6 h.Conclusion The ischemia/reperfusion-induced apoptosis of human gastric mucosal epithelial cells cultured in vitro was successfully simulated. This inju

9、ry model is able to induce apoptosis of gastric mucosal epithelial cells with a peak at the time point of reperfusive 6th h secondary to ischemic 1st h.Key words：gastric ischemia-reperfusion; gastric mucosa epithelial cell; cell apoptosis; cell culture胃缺血/再灌注(gastric ischemia-reperfusion, GI/R)损伤是一种

10、常见的临床病理生理过程，临床发生多器官障碍综合征时，由于血液的重分布造成的胃肠黏膜缺血出现的最早最明显，远比其他脏器更易发生缺血-再灌注损伤，因此，胃被认为是机体内最早受累的器官1-2。胃黏膜虽易损伤，但其修复快，它是机体内自身代谢最快的组织之一，这表明胃黏膜细胞可能具有较强的抗凋亡调控机制和增殖修复能力。深入研究GI-R的胃黏膜上皮细胞凋亡、增殖及其分子机制不仅有利于GI-R的防治，而且对于器官缺血/再灌注损伤理论的深入具有重要意义。以往研究多是采用夹闭腹腔动脉导致胃缺血/再灌注损伤的在体模型3-4，但由于体内环境的复杂性，在体研究受到诸多因素的干扰，也难以特异性地针对胃黏膜某一细胞进行研究

11、。故对于离体胃黏膜上皮细胞缺血-再灌注后损伤的研究具有十分重要的意义。本研究采用人胃黏膜上皮细胞株经体外培养及传代后建立模拟缺血/再灌注细胞损伤模型，观察在缺血-再灌注不同时间点胃黏膜上皮细胞凋亡的情况及其规律。1 材料和方法1.1 实验试剂及细胞株 DMEM/F12(11)培养基购自美国Hyclone公司;Hoechst33258、碘化吡啶(PI)染液购自美国Sigma公司;人胃黏膜上皮细胞株由北京肿瘤研究所提供。1.2 实验分组1.2.1 正常对照(control)组 正常环境下培养人胃黏膜上皮细胞。1.2.2 模拟缺血/再灌注损伤(I-R)组 更换模拟缺血液，于缺氧箱中缺氧、缺糖孵育1

12、h，更换模拟再灌注液，正常环境下分别进行再灌注孵育3、6、12 h。1.3 模拟缺血-再灌注诱导胃黏膜上皮细胞凋亡模型的建立 采用缺氧、缺糖、复氧、复糖的方法模拟在体的缺血/再灌注过程。参照文献的方法5-6，取胃黏膜上皮细胞接种在培养瓶中，待细胞生长至23天接近融合状态时，将上述培养基置换为无糖的模拟缺血液，在模拟缺血条件下(5% CO2、1% O2、94% N2、37的缺氧箱中缺氧、缺糖)培养1 h，之后将模拟缺血液吸尽并加入正常DMEM/F12(含10%的胎牛血清)培养基，放至普通培养箱中(5% CO2、37)继续培养不同时间。1.4 流式细胞仪分析细胞凋亡率 分别收集各组培养的胃黏膜上皮

13、细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后，用0.25%胰酶消化液制备单细胞悬液，以75%冷乙醇固定，置4 保存。向固定的细胞悬液中加入PBS，轻轻混匀，1 000 r/min离心5 min，去除固定液。再以PBS洗一次。加入RNase A和PI染色液4避光染色30 min后，用流式细胞仪检测分析细胞DNA含量，计算凋亡细胞百分率和凋亡峰，此峰的大小即代表凋亡细胞的多少。1.5 胃黏膜上皮细胞形态学观察 Hoechst33258染色法：吸尽培养液，加入0.5 ml 4%多聚甲醛固定细胞10 min;去除固定液，用MPBS洗2次;加入0.5 ml Hoechst33258染色液(10 mg/L) 37染色15 min;去染色液，用MPBS洗2次，去除过多的染色背景;荧光显微镜下观察(激发波长为350 nm，发射波长为460 nm)，细胞核呈致密浓染或呈碎块状致密浓染为凋亡阳性细胞。1.6 统计学处理 数据以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，P<0.05为有