第三章生物信息传递(上)—从DNA到RNA

1、第三章 生物信息传递（上）从DNA到RNA本章主要内容： RNA转录概述； RNA聚合酶（原核、真核）*； 启动子（原核*、真核）； 转录过程（原核*、真核）； 转录后的加工（真核生物mRNA转录后的加工）*一、 RNA转录概述基因表达：包括转录和翻译两个阶段。1、转录(transcription)定义：以DNA为模板，在依赖于DNA的RNA聚合酶的催化下，以 4种rNTP(ATP、CTP、GTP和UTP)为原料，合成RNA的过程。RNA是DNA将遗传信息传递给蛋白质的中心环节。在有些RNA病毒中，RNA也可以指导合成RNA。 转录是基因表达的第一步,也是最关键的一步转录过程涉及到两个方面:

2、RNA合成的酶学过程是RNA合成的起始信号和终止信号,也就是DNA分子上的特定序列2、原核细胞转录的基本过程模板识别：RNA聚合酶与启动子起始转录：RNA链上 第一个核苷酸键的产生。通过启动子：RNA聚合酶形成9个核苷酸短链后离开 启动子区。转录的延伸：在DNA一条链上通过碱基配对合成RAN链，解链区沿DNA移动，每秒合成5090个核苷酸。转录的终止：终止位点，RNA和RNA酶从DNAL链上脱落， 转录泡瓦解，DNA恢复双链状态。§ 编码链（coding strand）：不作模板转录的链，又称有义链（sense strand）§ 反义链(antisense strand)：

3、作为模板转录的链，又称模板链(template strand)。3、RNA功能： 单链形式存在于生物体内，贮藏及转移遗传信息 作为核酶在细胞内发挥其代谢功能 少数RNA病毒，RNA作为其遗传物质4、RNA合成的基本特征 合成RNA的底物磷酸酯键仅以DNA一条链作为模板RNA合成的方向是从53不需要引物，可以单独起始链的合成在合成时，第一个rNTP是以三磷酸形式存在的A-T，G-C，C-G，U-A合成的RNA序列和模板是互补的。5、RNA合成与DNA复制的区别：模板；引物；双链状态；底物；聚合酶§ 转录单位(transcription unit)：由启动子到终止子的序列 §

4、上游(upstream)：转录起始点（+1）前面的序列。（-10、-20） § 下游(downstream) ：转录起始点后面的序列。（+10、+20等）§ 单顺反子（ monocistron ）：一个mRNA仅编码一种蛋白质 。真核生物§ 多顺反子（ polycistron ）：几个结构基因，利用共同的启动子及共同的终止信号，经转录作用生成mRNA分子。二、RNA聚合酶1、原核生物的RNA聚合酶大肠杆菌RNA聚合酶- 2 大肠杆菌RNA聚合酶由多亚基组成。2称为全酶(holoenzyme)，分子量约为 480kDa。亚基与全酶结合疏松，应用磷酸纤维素柱很容易使之

5、与全酶分离。解离后的部分称为核心酶(Core enzyme)( 2)。全酶可以起始RNA的合成，之后亚基从全酶解离下来。全酶的组装过程可能如下: 2。各亚基的功能已有了一定的了解。2核心酶具有催化活性。因子使全酶识别启动子并与之结合，负责转录的起始。亚基参与全酶的组装及全酶识别启动子，还参与全酶与一些调控因子的作用。亚基具有与底物NTP及新生RNA链结合的能力。亚基参与模板结合，和亚基提供了RNA聚合酶的活性中心。亚基的功能：核心酶在DNA上滑动，亚基能增加酶与DNA启动子的结合常数，增加停留时间，使聚合酶迅速找到启动子并与之结合，亚基本身无催化活性。不同的因子识别不同的启动子，从而表达不同的

6、基因。2、真核生物的RNA聚合酶在真核生物细胞中，共有三类RNA聚合酶，即RNA聚合酶、和，分别负责三类基因的转录。分类的依据采用了根据对鹅膏蕈碱(- amanitine)的敏感性不同来分类的方法。它们在细胞核中的定位不同，对鹅膏蕈碱的敏感性有差异。动物、植物和昆虫的RNA聚合酶最不敏感，RNA聚合酶最敏感。不同来源的RNA聚合酶有些差异，动物细胞的RNA聚合酶的敏感性介于I和II之间，受高浓度的鹅膏蕈碱的抑制；酵母和昆虫的RNA聚合酶不受抑制。RNA聚合酶的抑制剂在分类上有一定的意义。在细胞核中，RNA聚合酶I位于核仁，活性所占比例最大，负责rRNA(5.8S、18S和 28S)的转录。由于

7、rRNA占总RNA的比例最大，所以RNA聚合酶I负责了大部分细胞 RNA的转录。RNA聚合酶II位于核质，活性所占比例次于RNA聚合酶I，主要负责核不均一RNA (heterogeneous nuclear RNA，hnRNA)、 (核内小分子RNA，small nuclear RNA)和mRMA前体的转录。RNA聚合酶也位于核质，活性所占比例最小，负责tRNA、5SrRNA、Alu序列和其他小RNA( snRNA)的转录。真核生物的RNA聚合酶的分子量均很大，为5OOkDa或更大。由8至14个亚基组成。经纯化的RNA聚合酶具有以DNA为模板合成RNA的能力，但不能正确的选择启动子。目前尚不能

8、完成RNA聚合酶的体外重建，所以无法确定哪些亚基是活性所必需的，哪些是活性所非必需，是不是所有的亚基都是活性所必需的。目前了解最为详细的是酿酒酵母，所有的亚基均n3找到了编码的基因，其中1011个亚基是活性所必需的。RNA聚合酶亚基§ 均含有核心酶2相同源的亚基§ 最大亚基与 E.coli RNA聚合酶中的亚基相似§ 第二亚基与E.coli 的含有活性位点的亚基相似§ 至少还有五种小亚基普遍存在于三种酶中，47种存在于特定的一种酶中三、启动子§ 启动子(promoter是指DNA分子上被RNA聚合酶识别并结合形成起始转录复合物的区域。它还包括一

9、些调节蛋白因子的结合位点。 1、原核生物启动子结构与功能 不同的启动子都存在保守的共同序列，包括RNA聚合酶识别位点和结合位点（1）转录起始点 转录起始点在多数情况(>90%)下为嘌呤，常见的序列为CAT, A为转录起始点 CAT的保守程度还不够高，因而不能做为固定的转录起始点序列 （2）-10序列（Pribnow框）§ Pribnow和Schaller于1975年发现§ 转录起点上游大约-10处§ 保守序列为TATAAT(T80、A95、T45、A69、A50、T96)§ 功能为：与RNA聚合酶紧密结合；形成开放启动子复合体；使RNA聚合酶定向转

10、录（3）-35序列（Sexfama box）§ 碱基出现频率如下：T85 T83 G81 A61 C69 A52 ，其中TTG十分保守。§ RNA酶的识别区域。§ 功能：原核RNA聚合酶全酶依靠因子的初始识别位点。§ 对RNA聚合酶全酶有很高的亲和性。§ -35序列的核苷酸结构，在很大程度上决定了启动子的强度，RNA聚合酶易识别强的启动子（4）-10区和-35区间的距离 § 90%的原核生物启动子为16到19bp§ 碱基的数目即该距离的长短却是至关重要的 § 适宜的距离可以为RNA聚合酶提供合适的空间结构 原核生物

11、启动子的特点 结构典型，都含有识别（R）、结合（B）和起始（I）三个位点。序列保守位置和距离都比较恒定。直接和RNA聚合酶相结合。多和操纵子相邻。都在其控制基因的5端。决定转录的启动和方向。2、 真核生物的启动子 1 RNA聚合酶I的启动子核心启动子： -45至+20的区域内(core promoter)上游调控元件：-180至-107,可提高核心启(upstream control element,UCE) 动子的转录起始效率 2 RNA聚合酶III的启动子§ 内部启动子：启动子位于转录起始点的下游 5S rRNA和tRNA § 上游启动子：snRNA OCT(八聚核苷酸

12、元件)、PSE(近端序列元件)、TATA(TATA框)3 RNA聚合酶II的启动子§ 上游元件§ 应答元件§ “通用”启动子：可在任何细胞内表达，没有组织特异性，不依赖于在组织特异性调控下使用的序列，有功能但效率低。（1）上游元件（upstream element）§ TATA box (TATAAAA ) 位于-2530bp 有些突变不影响转录的起始，但改变转录的起始位点§ CAAT box (GGCCAATCT)，位于-70-80bp 突变对转录起始频率影响很大 § GC box(GGGCGG)，位于 -80-110bp 影响不大

13、§ octamer(an 8bp element) 应答元件：可被一些起调控作用的转录因子识别，使基因对这些调节因子作出反应的序列（3）增强子（Enhancer） 增强子是与转录起始有关的位点，具有增强转录起始的作用。相对于启动子来说，增强子的位置不是固定的，变化很大（-珠蛋白）功能：增强子很可能通过影响染色质DNA-蛋白质结构或改变超螺旋的密度而改变模板的整体结构，从而使得RNA聚合酶更容易与模板DNA相结合，起始基因转录。四、转录机制（过程）§ 1、原核生物转录（1） 转录的起始 RNA聚合酶识别启动子并与之结合 从而启动RNA合成的过程 核心酶在因子的参与下与DNA分

14、子接触，形成非专一复合物 起始识别：全酶与启动子结合形成封闭的启动子复合物，这时酶与DNA的外部结合，识别部位大约在启动子的-35区处活化：形成开放的启动子复合物，酶在-10区紧密与启动子结合，解开双链后识别有意义链 形成三元起始复合物（启动子、全酶、核苷三磷酸）（2） 转录的延伸§ 转录起始后，亚基释放，离开核心酶，使核心酶的亚基构象变化，与DNA模板亲和力下降，在DNA上移动速度加快，使RNA链不断延长。40核苷酸/秒§ 旋转酶(gyrase)和拓扑异构酶I消除负超螺旋和正超螺旋 § 亚基便从全酶中解离出来，然后nusA亚基结合到核心酶上，由nusA亚基识别序

15、列（3） 转录终止§ RNA聚合酶到达转录终止点时，在终止辅助因子的帮助下，聚合反应停止，RNA链和聚合酶脱离DNA模板链§ nusA又被亚基所取代 终止点之前都有一个回文结构，它转录出来的RNA可以形成一个颈环式的发荚结构。在大肠杆菌中，有两种类型的终止子，一类为内在终止子(intrinsic terminator)，在体外实验中，只有核心酶和终止子就足以使转录终止，不依赖其他辅助因子；另一类终止子必须在因子(-factor)的存在下核心酶才能终止转录，因此称为依赖 因子的终止子(-dependent terminator)。第一类终止子又称为不依赖因子的终止子。二种类型

16、的终止子在结构上有一定的差异。a:不依赖因子的终止子： 不依赖因子的终止子结构特征：一是形成一个发夹结构(hairpin)，二是发夹结构末端紧跟着6个连续的U串。不同终止子的发夹结构长度有差异，在72Obp之间，由一反向重复序列构成茎，中间的间隔形成环。在茎的底部有一富含GC对的区域。发夹结构中的突变可阻止转录的终止，说明发夹结构的重要作用。经研究确定，新生RNA链的发夹结构可使RNA聚合酶催化的聚合反应暂停，暂停的时间不同终止子有所差异，但典型的终止子暂停时间为60秒左右。转录的终止并不只依赖于发夹结构，新生的RNA中可有多处发夹结构。RNA聚合酶的暂停只是为转录的终止提供了机会，如果没有终

17、止子序列，聚合酶可以继续转录，而不发生转录的终止。6个连续的U串可能为RNA聚合酶与模板的解离提供信号。RNA-DNA间的rU·dA结合力较弱，有利于RNA和DNA的解离。如果将U串缺失或缩短，尽管RNA聚合酶可以发生暂停，但不能使转录终止。DNA上与U串对应的为富含AT对的区域，这说明AT富含区在转录的终止和起始中均起重要的作用。b:依赖的终止子依赖的终止子，必需在因子存在时，才发生终止作用。终止点前无寡聚U序列，回文对称区不富含GC因子§ 分子量为46kDa，活性形式为六聚体，270kDa § 有依赖RNA的 ATPase活性 § 与新生RNA在终止

18、子上游的某一处与RNA结合 § 因子具有使RNA-DNA杂交体解离的作用 （1） 真核生物转录的起始过程（a）RNA聚合酶I的转录起始： 需要两个转录因子§ UBF1:一条多肽链组成 具有序列特异性:识别核心启动子和UCE中富含GC对的区域 § SL1 具有种属特异性（b）RNA聚合酶III的转录起始锌指 一组保守的氨基酸结合了一个锌离子，在蛋白质中形成了独立的结构域§ 功能 结合DNA；结合蛋白质（同二聚体，异二聚体）;激活转录（c）RNA聚合酶II的转录因子§ 通用启动子 基础转录因子 （2） 真核生物转录的延伸和终止§ 靠多种辅

19、助因子的共同作用下来延伸新链 § 终止机理不清楚： RNA聚合酶I ：辅助因子识别一18bp的终止子序列 RNA聚合酶II和 与原核相似，RAN聚合酶识别 终止子五、RNA转录后的加工 RNA聚合酶合成的原初转录产物，要经过剪切、修饰、拼接等过程，才能转变成成熟的RNA分子，此过程称RNA转录后的加工1、原核生物转录后的加工（1） 原核tRNA、rRNA（稳定的RNA）a. tRNA、rRNA 5 '是单磷酸b. 成熟 tRNA、rRNA分子都比原初转录物小c. 所有的tRNA分子，都有原初转录物所没有的稀有碱基 （A、G、C、U以外的碱基）（2） 原核mRNA§

20、半衰期短§ 以多顺反子的形式存在§ 5端无帽子结构，3端没有或只有短的poly(A)结构（3） 原核生物rRNA、tRNA的加工 rRNA基因与某些tRNA基因组成混合并与编码蛋白质的基因组成操纵子，在形成多顺反子转录物后，断裂成为rRNA和tRNA的前体，然后进一步加工成熟。（4） 原核mRNA前体的加工 单顺反子构成mRNA，不需加工，直接进行翻译。 多顺反子构成mRNA，核酸内切酶切成较小的mRNA， 再进行翻译。 例：核糖体大亚基蛋白L10、L7、L12与RNA聚合酶、亚基的基因组成混合操纵子 2、真核生物转录后的加工（1）真核生物的mRNA§ a: 5端

21、存在帽子结构：甲基化的鸟嘌呤帽子结构的功能 ：使mRNA免受核酸酶的降解，增加mRNA的稳定性有助于mRNA越过核膜，进入细胞质使mRNA能与核糖体小亚基结合并开始合成蛋白质被蛋白质起始因子识别与某些RNA病毒的正链RNA的合成有关§ b: 3端存在 poly(A)结构 polyA的功能:提高mRNA在细胞质中的稳定性。协助mRNA从细胞核向细胞质转运。作为核糖体的识别信号，使mRNA分子有效翻译。对基因的表达调控有重要作用。（2）tRNA、rRNA的加工A:   tRNA前体的拼接酵母tRNA约有400个基因，有内含子的基因约占1/10，内含子长度14-46bp

22、，没有保守性。切除内含子的酶识别的是tRNA的二级结构，而不是什么保守序列。拼接过程：第一步切除内含子，第二步RNA连接酶将两个tRNA半分子连接。 B: 四膜虫rRNA前体的自我拼接 四膜虫35S rRNA前体，经加工可以生成5.8S 、17S和26SrRNA。 某些品系的四膜虫在其26SrRNA基因中有一个内含子，35S rRNA前体需要拼接除去内含子。 （3）真核生物mRNA前体的加工§ mRNA原初转录物是分子量很大的前体，在核内加工过程中形成分子大小不等的中间产物，它们被称为核内不均一RNA（hnRNA）。其中，约有25%可转变成成熟的mRNA（1） 

23、5'末端加帽 RNA三磷酸酶，mRNA鸟苷酰转移酶，mRNA（鸟嘌呤-7）甲基转移酶，mRNA（核苷-2 ' ）甲基转移酶。由于甲基化的程度不同，有三种类型的帽子：CAP O型，CAP I型，CAP II型。 5 '帽子也出现于hnRNA，说明加帽过程可能在转录的早期阶段或转录终止前就已完成。（2）3端加poly（A） 内切酶RNAase切断，多聚A聚合酶催化，加上polyA，ATP为供体。 加尾信号：AAUAAA（转录终止点上游15-30bp） 核内hnRNA的3 '端也有多聚腺苷酸，表明加尾过程早在核内已经完成。hnRNA中的poly（A）平均150-200nt。（3）内含子的剪接、编辑及化学修饰RNA中的内含子内含子：外显子：断裂基因：一个基因由多个内含子和外显子间隔而成。a:生物体内各种内含子