罗格列酮对高糖诱导的血管内皮细胞炎症的抑制作用_图文

1、文章编号 1007 3949(201018 04 0265 04实验研究罗格列酮对高糖诱导的血管内皮细胞炎症的抑制作用牛红心1,刘章锁2,龙海波1(1.南方医科大学珠江医院肾内科,广东省广州市510282;2.郑州大学第一附属医院肾内科,河南省郑州市450052关键词 糖尿病; 罗格列酮; 血管内皮细胞; 内皮功能失常摘 要 目的 阐明罗格列酮对糖尿病血管并发症保护作用的分子机制。方法 用凝胶迁移分析和免疫荧光法测定不同浓度罗格列酮干预前后高糖诱导的血管内皮细胞核因子 B 激活和血管细胞黏附分子1表达的改变。结果 25mm o l/L D 葡萄糖刺激30m i n 可诱导细胞核因子 B 向核内

2、迁移(与基础水平相比,P <0.001;5、25 mo l/L 罗格列酮以剂量依赖的方式抑制了D 葡萄糖诱导这种效应,抑制率分别为25.17%(P =0.001和51.79%(P <0.001。罗格列酮还抑制了D 葡萄糖诱导的血管细胞黏附分子1高表达。结论 罗格列酮通过抑制血管内皮细胞炎症起到直接保护血管作用,可能是其延缓和改善糖尿病血管并发症的机制之一。中图分类号 R 96文献标识码 ARosiglitazone Prevents H igh G lucose I nduced I nfla mm ation in Vascular Endot helial CellsN I U

3、 H ong X i n 1,L IU Zhang Suo 2,and L ong H a i Bo 1(1.Depa rt m e n t of N e phrology,Zhujiang H ospital ,S ou t hern M edical Universit y ,Guang zhou,Guangd ong 510282,Ch i na;2.D e part m ent of N e phrology ,t h e F irstAffiliate d H ospit a l ,Z he ngzhou Universit y ,Zheng zhou,H enan 450052,C

4、h i na KEY W ORDS D iabe tes ; R osig litazone ; V ascular Endothelial Ce lls ; Endo t he lial D ysf uncti on AB STRACT A i m T o c l a rify t he m o l ecular m echan is m of pro tecti ve effect o f ro si g li tazone on vascu lar co m plica ti on o f d i abetes . M e thods H u m an u m bilical vascu

5、 lar endothe li a l ce lls (HUVECwere exposed to mediu m o r hi gh g lucose i n t he presence or absence o f d ifferen t doses o f ros i g litazone . N uc l ear translocati on of nuclear factor B (NF B w as m easured using the e lectrophoretic m ob ilit y sh ift assay and i m muno fluo rescence . Ex

6、pressi on o f v ascu l a r ce ll adhesi on m o l ecule 1(V C AM 1w as deter m i ned by i m muno fl uo rescence . R esu lts 25mm o l/L D g l uco se sign ifi cantl y i nduced nu c lear translocati on of NF B i n HUV EC (P <0.001vs that of basa l l eve l ,wh ich w as prevented by 5and 25 m o l/L of

7、ros i g litazone i n a dose dependen tm anner . T he s uppression ra te w as 25.17%(P =0.001and 51.79%(P <0.001. Ros i g litazone also prevented the i ncreased expressi on of VCAM 1i nduced by D g l ucose . Conc l usion R osig litazone d irectly protec ts vascular f unction v ia i nh i b ition o

8、f i nfla mm ation i n vascular endothe li a l cell s and tha t i s perhaps one o f the m echan is m s of rosig litazone i m prov ing vascu l ar co m plica ti on o f diabetes .作者简介 牛红心,博士,副主任医师,主要研究方向为氧化应激与肾脏疾病诊治,E m ail 为nhongxi n126.co m 。刘章锁,博士,主任医师,教授,博士研究生导师,主要研究方向为糖尿病肾病发病机制,E m ail 为zhangs uoLI

9、Usina .co m 。龙海波,博士,主任医师,副教授,主要研究方向为糖尿病肾病发病机制,E m ail 为l ym l hb cj hot m ai.l co m 。噻唑烷二酮(tiazolidined i o nes ,TZD 是治疗2型糖尿病的口服药,属于胰岛素增敏剂,通过激活过氧化体增殖物激活型受体 (per ox iso m e proliferator acti v ated receptors ga mm a ,PP AR 起作用,主要调节糖、脂代谢,改善胰岛素抵抗,还具有改善内皮功能、抑制系统炎症等作用,对糖尿病大血管1和微血管2并发症起保护作用。近期研究显示,在细胞和分子水

10、平,TZD 的生物学作用还可通过不依赖PP AR 激活的途径来实现,如通过减少内皮素的合成和释放、增加一氧化氮生物利用度、减少高糖诱导的氧化应激等3,然而其机制并不十分清楚。为了进一步明确TZD 对糖尿病血管并发症保护作用的分子机制,本文以体外培养的人脐静脉内皮细胞(hum an u m b ilical ve i n endo the li a l ce lls ,HUVEC 作为内皮模型,观察罗格列酮干预前后高糖诱导的核因子 B(nuclear factor B ,NF B 激活和血管细胞黏附分子1(vascular ce ll adhesion m olecule 1,VCAM 1表达的

11、改变。1 材料和方法1.1 试剂RP M I 1640培养液(H yC lone ,Logan ,U tah,D 葡萄糖(S i g m a aldrich ,Lou is ,MO ,罗格列酮(葛兰素史克,天津,中国,兔抗人NF B /p65、NF B /p50、VCAM 1抗体(San ta Cruz B iotechno logy ,I nc ,Santa C ruz ,C A ,FI T C 标记猪抗兔I gG(D akoCyto m ati o n,G lostr up,Den m ark,碘化丙啶(prop i d i u m io d i d e,PI,S i g m a,D i

12、g Ge lSh iftK it(Roche Applied Sc i ence,M annhe i m,Ger m any,NF B双链寡核苷酸探针(Pr o m ega,M ad ison,W I,尼龙膜(Am ersha m,Sw e den。1.2 细胞培养按照我们以往的方法4分离和培养HUVEC。在37 、5%C O2和95%空气条件下,细胞生长于含20%人AB血清、80kU/L青霉素、80m g/L链霉素的RP M I1640培养液中,以1 2传代,第13代细胞用于实验。1.3 凝胶迁移分析法测定核因子 B激活HUVEC培养至接近汇合,在含1%人AB血清的RP M I1640培养液

13、中静止12h,分别将5、25 m o l/L罗格列酮提前1h加入培养液,再以25 mmo l/L D 葡萄糖刺激细胞30m in。以25mm o l/L 甘露醇作为对照。收集细胞,按照我们以往的方法5提取细胞核蛋白。按照试剂盒说明用D igox i g e n i n标记NF B寡核苷酸探针(探针序列为5 AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C 3 和3 TCA ACT CCC CTG AAA GGG TCC G 5 。在结合反应体系(结合缓冲液4 L、polyd(I C1 g、poly L lysi n e 0.1 g、样品核蛋白10 g、寡核苷酸探针3.5p m o l

14、中使核蛋白样本中NF B与已标记的寡核苷酸探针结合。为了检测特异性,在一组反应体系中提前1h加入125倍未标记的NF B寡核苷酸探针,行竞争试验。在另两组反应体系中分别加入兔抗NF B/p65或NF B/p50抗体各2.5 g,4 条件下孵育12h,行超迁移试验。反应结束后,在上述反应体系中各加入5 L上样缓冲液,行6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,电转印至正电荷尼龙膜,120 烤20 m in,漂洗和封闭后,加入碱性磷酸酶标记的抗D ig ox i n genin抗体,加入CSPD显影、曝光,以Quantity One凝胶图像分析系统(B io Rad,H ercules,C A分析结果。1.4

15、 免疫荧光观察核因子 B激活HUVEC培养在置有盖玻片的细胞培养板上,生长至70%汇合,静止后,分别将5、25 m ol/L罗格列酮提前1h加入培养液中,再以25mm o l/L D 葡萄糖刺激细胞30m in。固定、漂洗、封闭后,加入兔抗NF B/p65抗体(10m g/L,4 过夜,洗板,FI TC 标记猪抗兔Ig G(1 2037 避光孵育45m i n。洗后,PI(10m g/L室温避光孵育10m in。在共聚焦显微镜(Le ica TCS SP2AOBS,Le i c a M icrosyste m s, Ca m bri d ge,UK下观察、摄像。1.5 血管细胞黏附分子1表达的

16、测定HUVEC培养于置有盖玻片的细胞培养板上,生长至70%汇合,静止后,将25 m o l/L罗格列酮提前1h加入培养液,再以25mm o l/L D 葡萄糖刺激细胞6h。用免疫荧光化学染色法检测VCAM 1表达。一抗为兔抗VCAM 1抗体(1 100,其余方法同上。1.6 细胞活力的测定HUVEC培养至接近汇合,静止后,用分别以25 mm o l/L D 葡萄糖处理细胞30m in和6h,及25 m o l/L罗格列酮处理1h。用MTT法测定细胞活力。1.7 统计学处理实验重复3次或以上,数据以x s表示。采用One w ay ANOVA比较总体及组间差异,对于方差齐的数据采用SNK和LSD

17、作两两比较,对于方差不齐的数据采用DunnettT3作两两比较。2 结果2.1 高糖对血管内皮细胞核因子 B的影响2.1.1 凝胶迁移分析结果 25mm o l/L D 葡萄糖刺激30m i n可诱导细胞NF B向核内迁移,为基础水平的9.52倍(P<0.001,而甘露醇对NF B 无影响(P=0.985,提示NF B的激活是D 葡萄糖本身而非高渗透性作用造成的(表1和图1。竞争试验中使用过量未标记的NF B寡核苷酸探针抑制了NF B与标记的寡核苷酸探针的结合,抑制率为86.45%(与高糖组相比,P=0.011,证实了核蛋白与DNA结合的特异性。在超迁移试验中,使用特异性抗p65和p50

18、抗体抑制了NF B与寡核苷酸探针的结合,抑制率分别为64.77%(与高糖组相比,P=0.038和70.51%(与高糖组相比,P= 0.024,说明NF B复合物主要由p65和p50构成(表2和图2。又由于D 葡萄糖刺激30m in对细胞活力没有影响(P=0.678,提示高糖对细胞NF B的影响也并非因细胞活力改变所致(表3。2.1.2 免疫荧光结果 为了进一步证实高糖对血管内皮细胞NF B的激活作用,用兔抗人p65抗体进行免疫荧光化学染色,共聚焦显微镜观察发现未受刺激细胞胞浆有较强的绿色荧光(p65,而细胞核显示红色荧光(PI;25mm o l/L D 葡萄糖刺激30m i n后,多数细胞胞核

19、有明显的绿色荧光着色,与PI的红色荧光叠加后呈桔黄色(图3。提示25 mm o l/L D 葡萄糖可诱导NF B/p65亚单位从胞浆向核内迁移。2.2 罗格列酮对高糖诱导的内皮细胞核因子 B 的抑制作用罗格列酮以剂量依赖方式抑制D 葡萄糖诱导的NF B激活,抑制率分别为25.17%(P=0.001和51.79%(P<0.001;表1和图1。25 m ol/L罗格列酮对细胞活力没有影响(与溶媒对照组相比,P =0.794(表3,提示罗格列酮对高糖诱导的NF B激活的抑制作用并非因抑制细胞活力所致。免疫荧光化学染色显示,随着罗格列酮浓度的增加,细胞核内绿色荧光(p65强度减弱,PI的红色荧光

20、强度增加。说明罗格列酮可以抑制D 葡萄糖诱导的NF B激活和NF B的核迁移,这种抑制作用随罗格列酮剂量增加而增强(图3。表1.罗格列酮对高糖诱导的核因子 B激活的抑制作用分 组n光密度比值高糖+5 mo l/L罗格列酮组37.12 1.07a b高糖+25 m ol/L罗格列酮组34.59 0.34a ba为P<0.01,与溶媒对照组相比;b为P<0.01,与高糖组相比。分 组n光密度比值a为P<0.05,与高糖组相比。分 组n吸光度比值2.3 罗格列酮对高糖诱导的内皮细胞血管细胞黏附分子1表达的抑制作用免疫荧光化学染色可见HUVEC胞质中和胞膜上均有VCAM 1表达,细胞

21、暴露于25mm o l/L D 葡萄糖6h后,VCAM 1蛋白表达增加,荧光强度增强。25 m ol/L罗格列酮预孵育细胞明显抑制了高糖诱导的VCAM 1蛋白高表达(图4。同样,25mm o l/L D 葡萄糖刺激6h(与溶媒对照组相比,P= 0.641和25 m o l/L罗格列酮刺激1h对细胞活力没有影响(表3,说明高糖诱导VCAM 1高表达和罗格列酮对高糖诱导的VC AM 1的抑制作用与细胞 活力的改变无关。 图4.罗格列酮对高糖诱导的血管细胞黏附分子1激活的影响( 400 从左到右依次为VCAM 1、PI和VCA M 1+PI;从上到下依次为溶媒对照组、高糖组和25 mo l/L罗格列

22、酮组。3 讨论大血管和微血管病变是糖尿病最主要的慢性并发症,可导致肾功能不全、失明、心血管疾病等。高血糖使体内固有免疫系统激活和微炎症状态持续存在,因此,新的观点认为糖尿病本质上是一种炎症性疾病6。内皮被覆于血管壁表面,直接感知血液循环中的信号(包括高血糖的刺激并做出相应的反应,内皮炎症性损伤和内皮功能失常,与糖尿病的血管并发症关系更为密切7。因此,将内皮炎症和内皮功能失常作为干预的靶点,可能是预防和延缓糖尿病的血管并发症的有效策略。NF B是氧化应激敏感的转录因子,激活后进入细胞核,与多种炎症因子的DNA启动子上NF B 序列结合,启动多种促炎症细胞因子、黏附分子、趋化因子和生长因子等的基因

23、转录,从而参与机体防御功能和炎症反应。NF B存在于内皮细胞,对血管内皮炎症因子表达起关键调控作用。因此,抑制NF B活性,可能成为控制血管炎症、延缓和改善糖尿病血管并发症的关键途径。C eo l o tto等3发现罗格列酮可完全消除高糖诱导的血管内皮细胞内活性氧产生,由于NF B对氧化应激敏感,推测罗格列酮可能对NF B起作用。我们在用高糖刺激血管内皮细胞之前,在培养液中加入不同浓度的罗格列酮,结果显示罗格列酮以剂量依赖的方式抑制了高糖诱导的血管内皮细胞NF B的激活。黏附分子是一类存在于细胞表面,介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质相互作用的糖蛋白分子,其基因的表达受到NF B等转录因子的调控

24、。VCAM 1主要由血管内皮细胞表达,在胞外含有免疫球蛋白样结构域,可作为配体与白细胞表面表达的淋巴细胞相关抗原1(LFA 1和巨噬细胞1(M ac 1分子结合,介导白细胞(特别是单核细胞与血管内皮细胞黏附和白细胞活化,促发炎症反应。本研究结果显示罗格列酮可以抑制高糖诱导的VCAM 1高表达,提示罗格列酮具有抑制糖尿病血管内皮炎症的作用,这种作用可能是通过抑制转录因子的激活实现的。其它研究也表明,TZD可通过减轻氧化应激,改善糖尿病大鼠的内皮功能8,抑制TNF 诱导的内皮细胞细胞间黏附分子1(I CAM 1表达9,这些作用与PPAR 和代谢作用无关。本研究证明罗格列酮通过抑制血管内皮细胞NF

25、B激活和黏附分子表达,而抑制糖尿病血管内皮炎症,对糖尿病血管内皮功能起直接保护作用,为糖尿病慢性并发症的防治提供了新的途径和理论依据。参考文献1 刘宽芝,吕海莉,王伟超,等. 罗格列酮对2型糖尿病大鼠大血管病变的防治作用及其分子机制J. 中国动脉硬化杂志,2006,14(2:93 96.2 刘章锁,牛红心,程根阳,等. 罗格列酮对糖尿病大鼠肾保护机制的研究J. 中华肾脏病杂志,2004,20(2:109 112.3 Ceo l o t to G,G all o A,Pappare ll a I,e t a.l Rosi g lit azo ne reduces g l ucosei nduce

26、d ox i da ti ve stress m e d i ated by NAD(PH o x i dase v i a AMPK depe ndent m echanis mJ. A rteri o scl er T hro m b Vasc Biol,2007,27(12:2627 633.4 牛红心,吕文成,阎晓. 人脐静脉内皮细胞培养方法的改进及其优势J. 广东医学,2009,30(11:1621 624.5 G uo Z J,N i uH X,H ou FF,et a.l A dvance d ox i da ti on pro t e i n products a cti vate vasc u l ar endothe li a l cells v i a a RAGE m ediate d si gnali ng pa t hway J. Antio x i d Redo x Si gnal,2008,10(10:1699 712.6 R i vero A,M ora C,MurosM,et a.l Pa t hog e n i c pe r