抗Ⅱ型胶原抗体的检测及其在类风湿关节炎中的意义

1、抗型胶原抗体的检测及其在类风湿关节炎中的意义         【摘要】目的了解抗型胶原抗体在类风湿关节炎(RA)中的临床意义。方法以改进的酶联免疫吸附法(ELISA)检测179例RA患者和171例其他风湿病患者的血清IgG型抗天然及抗变性型胶原抗体水平。结果RA患者抗天然和抗变性型胶原抗体阳性率各为22.3%和36.9%，早期RA患者各为30.0%和36.7%。其他风湿病患者中各为3.5%和31.6%，健康人二者均为2.5%。抗天然型胶原抗体阳性RA患者类风湿因子检出率、患者对病情活动性评价高于阴性组(P0.05)

2、。抗变性型胶原抗体和抗天然型胶原抗体同时阳性RA患者的CRP平均水平较高。结论抗天然型胶原抗体可以作为RA的一个辅助诊断指标。抗天然与抗变性型胶原抗体的检测有助于判断RA病情活动性。 Anti-type collagen antibodies in rheumatoid arthritis  【Abstract】ObjectiveTo investigate the clinical significance of anti-type-collagens antibody in rheumatoid arthritis (RA).MethodSerum IgG antibodies

3、to native and denatured type collagens (anti-nc and anti-dc ) were detected in 179 patients with RA by an improved enzyme linked immunosorbent assay (ELISA),and their clinical significance was analysed with corresponding clinical materials.ResultsIn RA,the positive rates of anti-nc and anti-dc were

4、22.3% and 36.9%;in early RA were 30.0% and 36.7%,respectively.In other rheumatic diseases the positive rates were 3.5% and 31.6%,respectively and were both 2.5% in healthy controls.Anti-nc positive RA showed higher prevalence rate of RF and higher scores of patients global assessment of disease acti

5、vity (P 0.05).The presence of anti-nc and anti-dc concomitantly was associated with high CRP level in RA patients.ConclusionAnti-nc could serve as a supplemental parameter in diagnosing RA and together with anti-dc may help evaluate the disease activity. 【Key words】Rheumatoid arthritis;Anti-type col

6、lagen antibody;Enzyme-linked immunosorbent assay;C-reactive protein 抗型胶原抗体(antibodies to type collagen)与类风湿关节炎(RA)病情活动性、严重性的关系目前仍有争论。本研究参照Fujii等1提出的实验条件检测179例RA患者、171例其他风湿病和118名正常人血清的抗型胶原抗体，探讨其在RA中的临床意义。结果报告如下。 1资料与方法 1.1一般资料 1.1.1病人组：为1994年9月至1999年3月在汕头大学医学院第一附属医院风湿科住院、门诊、随访的RA患者，共179例，全部符合1987年美国风

7、湿病协会(ARA)的RA分类标准2。其中男性53例，女性126例，年龄1776岁，平均46.3岁。其中病程1年之内，X线未出现明显骨质破坏者(以下简称早期病例)30例。 1.1.2对照组：共289例，分为两组：一组为同期在汕头大学医学院第一附属医院风湿科门诊或住院的非RA的其他风湿性疾病患者171例；另一组为正常对照组，共118名。 1.2抗型胶原抗体的体测 参照Fujii等1的方法。 1.2.1微量反应板的包被及封闭：正常羊血清于62 加热20 min，加入固体Tris (0.05 mol/L)、NaCl (0.15 mol/L)和2 mol/L HCl，调pH值至8备用(BNGS)。天然型

8、胶原在46 水浴中加热20 min，即为变性胶原。 将天然型和变性型胶原分别溶解于0.05 mol/L的醋酸中，浓度为3 mg/ml。0.02 mol/L磷酸缓冲液(PB) pH 7.6稀释胶原溶液，使浓度为40 g/ml，加入微量反应板孔，每孔100 l，保鲜膜覆盖，4 过夜。 在与待检血清标本进行温育之前，包被好的微量反应板用含0.05%吐温20的生理盐水溶液洗涤3次，然后每孔加入100 l BNGS，室温(2428 )下封闭30 min，洗涤液洗涤3次。 1.2.2检测：BNGS稀释待检及阳性对照、阴性对照血清，转入微量反应板的微孔中，设二孔平行，每孔100 l，同时设空白对照。室温温育

9、2 h，生理盐水-吐温溶液洗涤3次。含25%BNGS的0.1 mol/L TBS pH 8.0溶液稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG，每反应 孔加入100 l，室温温育2 h，洗涤。将联苯二胺和过氧化氢溶解于柠檬酸-磷酸缓冲液pH 5.0中，使各自浓度分别为0.05%和0.017%，加入反应孔，每孔100 l，37 温育30 min后每孔加入终止液1.25 mol/L硫酸50 l终止反应，酶标分光光度计492 nm处测吸光度(A)值。 1.2.3结果判断：以正常血清的平均A值加3个标准差作为正常值上限，待检血清A值超过者即被认为是阳性。    

10、0;   1.3统计学处理 计量资料数据采用t检验，计数资料数据采用2检验。 2结果 2.1ELISA工作浓度的选择：为便于比较，选择工作浓度时以天然型胶原作为包被抗原，测定血清抗天然型胶原抗体水平。 参照文献3的方法进行。结果表明，型胶原包被液浓度以40 g/ml，第二抗体辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG稀释度以1400，血清以140稀释为最佳。 2.2RA患者及对照组血清抗型胶原抗体检测结果：179例RA患者中，抗天然型胶原抗体阳性者40例，阳性率22.3%，显著高于健康人和疾病对照组(3.5%和2.5%)(P0.05)；抗变性型胶原抗体阳性者66例，阳性率36

11、.9%，与正常对照组(2.5%)相比差异有极显著性(P0.000 1)，与其他风湿病(31.6%)差异不大。30例早期RA患者抗天然型胶原抗体阳性9例，阳性率为30.0%。 抗天然型胶原抗体对RA诊断的敏感性为22.3%，特异性为96.9%，抗变性型胶原抗体对RA诊断的敏感性为36.9%，特异性为80.3%。 2.3抗型胶原抗体与RA病情的关系：抗天然型胶原抗体阳性患者RF阳性率高于阴性组(79.5%对61.8%，P0.041)，病情活动评分较高(8.5±9.5对6.6±1.5，P0.027)。抗变性型胶原抗体阳性RA患者血清CRP平均水平较阴性组高(24.8%对19.6%

12、，P0.003)。晨僵时间、压痛关节数、肿胀关节数、干燥综合征并发率、类风湿结节的发生率、功能分级二组间无统计学差异。IgG、IgM、IgA、-球蛋白，ESR水平、ANA阳性率及滴度、放射学病情进展及使用SAARDs的比例等方面在阳性组与阴性组无差异。抗变性型胶原抗体阳性的早期RA患者ESR、CRP水平较阴性组增高(P0.05)。 27例抗天然型胶原抗体阳性RA患者抗变性型胶原抗体同时阳性。本组病人RF检出率高于其他RA患者(P0.05)。CRP水平也较高(19.6±17.5对16.8±16.0，P0.007)。      

13、3讨论 抗型胶原抗体检测方法有多种，目前以ELISA法应用最为广泛。Fujii等1比较了吐温20、牛血清白蛋白和一些动物血清(如兔、鸡、牛、羊)阻止人血清免疫球蛋白与酶标微量反应板的吸附作用后认为，与其他动物血清及吐温20相比，兔和羊血清减少非特异性吸附作用效果最好。他用正常新鲜兔血清封闭酶标反应板，使RA病人与健康对照者血清的抗型胶原抗体滴度差异明朗化，并进一步提出该抗体可作为RA的一早期诊断指标4。我们虽未做多种动物血清封闭酶标反应板的比较，但通过采用Fujii等改进的ELISA检测血清抗型胶原抗体水平后我们发现，对照组抗天然型胶原抗体阳性率甚低，使其对RA的诊断特异性达96.9%，在早期

14、RA中敏感性略高于非早期RA患者，表明该抗体的检测可以作为对RA诊断的一个补充。 本组RF检出率在抗天然型胶原抗体阳性RA患者较阴性组高，且有统计学意义。与林冰等5所观察到的结果一致。国外的报道多认为抗天然型胶原抗体阳性与RF检出率无关6。是否存在人种差异，有待进一步证实。 CRP为一急性时相反应产物，其水平可作为判断RA活动性的一个指标。Morgan等7报道仅部分RA患者CRP与抗天然及抗变性型胶原抗体 水平相关。本组179例RA患者抗变性型胶原抗体阳性者血清CRP平均水平明显高于阴性组，且有高度的统计学意义。抗天然型胶原抗体阳性组患者CRP水平偏高。早期RA抗变性型胶原抗体阳性患者ESR、

15、CRP水平显著较阴性者为高，提示这组患者炎症活动似更为显著。 Charriere等8研究认为，抗天然型胶原抗体阳性与患者X线病情进展较慢、较轻有关。但林冰等5报道抗天然型胶原抗体阳性RA患者关节X线分期较高，认为该组病人病情更重。我们的研究未发现抗天然型胶原抗体阳性组与阴性组在放射学分期、Sharp评分上有统计意义的差别。 在本研究中，RA患者抗天然型胶原抗体阳性者抗变性型胶原抗体多呈阳性，单纯抗天然型胶原抗体阳性者较少(占全部抗天然型胶原抗体阳性RA患者的31.7%)。进一步分析抗天然和抗变性型胶原抗体与临床的关系发现，抗天然型胶原抗体阳性与否对抗变性型胶原抗体与CRP水平的关系有影响：当抗

16、天然型胶原抗体阴性时，抗变性型胶原抗体与CRP水平即无明显关系，表明抗天然型胶原抗体状况对活动性同样起着关键作用，检测抗型胶原抗体有助于对RA活动性的估计。 参 考 文 献 1,Fujii K,Tsuji M,Murota K,et al.An improved enzyme-linked immunosorbent assay of anti-collagen antibodies in human serum.J Immunol Methods,1989,124:63-70. 2,Arnett FC,Edworthy SM,Bloch DA,et al.The American Rheum

17、atism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis.Arthritis Rheum,1988,31:315-324.        3,马东来，张敏，许华林，等.类风湿关节炎患者血清型胶原抗体检测.中国实验临床免疫学杂志，1996，8：28-30. 4,Fujii K,Tsuji M,Kitamura A,et al.The diagnostic significance of anti-typ

18、e collagen antibody assay in rheumatoid arthritis.Int Orthop,1992,16:272-276. 5,林冰，吴东海，张荣富，等.类风湿关节炎患者抗天然型胶原抗体的测定及临床意义.中国康复医学杂志，1997，12：170-172. 6,Choi EK,Gateaby PA,McGill NW,et al.Autoantibodies to type collagen:occurrence in rheumatoid arthritis,other arthritides,autoimmune connective tissue diseases,and chronic inflammatory syndromes.Ann Rheum Dis,1988,47:313. 7,Morgan K,Clague RB,Collins I,et&