基因组DNA甲基化研究综述

1、目录摘要·················································&#

2、183;·················································&#

3、183;···························1Abstract·····················

4、;··················································

5、;··················································

6、;11 甲基化机制················································

7、83;·················································

8、83;···········3 1.1 动物中DNA甲基化机制···································

9、3;··············································3 1.2 植物中DNA甲基化机制·

10、;··················································

11、;·······························4 1.3 DNA甲基化与组蛋白甲基化的关系···············&

12、#183;···············································5 1.4 甲基化DNA抑

13、制基因转录沉默的机制················································&#

14、183;········62 甲基化研究技术·······································

15、3;·················································

16、3;···········7 2.1 甲基化敏感扩增多态性····································

17、·············································8 2.2 单分子实时测序法直接检测DNA甲基化·

18、··················································

19、··9 2.3 依赖于单分子纳米孔技术的测序············································

20、3;····················93 甲基化应用····························&#

21、183;·················································&#

22、183;····························10 3.1 DNA甲基化在植物中的应用··················

23、··················································

24、····10 3.2 DNA甲基化在动物中的应用··········································

25、3;·····························104 展望···················

26、3;·················································

27、3;·················································12参考

28、文献·················································

29、3;·················································

30、3;···············13基因组DNA甲基化研究进展摘要：动植物基因组中存在广泛的DNA甲基化修饰，主要存在于CpG和CpNpG位点。作为表观遗传学最重要的现象之一，DNA甲基化在调控自身基因表达，抵御外来入侵DNA、转座子元件及转基因沉默从而维持基因组稳定等方面具有重要作用。文章主要对甲基化的发生、作用机制，甲基化研究相关技术及甲基化研究应用方面做了简要介绍。关键词：表观遗传；DNA；甲基化；甲基转移酶；组蛋白Advances of

31、 Research on Genomic DNA methylationPengfei liu(College of Life Science，Guizhou University，GuiYang 550025，China)Abstract：DNA methylation is widely exist in plant and animal genomes, its mainly modification sites is the CpG and CpNpG loci. As one of the most important phenomenon of epigenetics, DNA m

32、ethylation plays an important role in maintaining the genomic stability ,which involves the regulation of gene expression, against the invader DNA, transposon components and transgenic silence, etc. This article mainly discusses the mechanism of methylation and the technologies of methylation resear

33、ch，then gave a brief introduction of the application of DNA methylation.Key words：epigenetic；DNA；methylation；methyltransferase；histone 表观遗传学(epigenetics)这一术语首先由生物学家Waddington在1939年提出。现在对表观遗传变异的定义为，在不改变DNA序列的条件下，发生的可遗传的变异。近年来，作为非孟德尔式遗传的表观遗传学现象越来越受到学者的关注，已成为生物学研究领域的一个热点。表观遗传主要包括DNA甲基化(DNA methylation)

34、，组蛋白修饰(Histone modifications)，染色质重塑（chromatin remodeling），基因组印记（genomic imprinting）,调控性的小分子RNA（miRNA、siRNA、piRNA、lncRNA）等。DNA 甲基化是指在DNA甲基转移酶(DNA-methyltransferases, DNMTs)的催化下, CpG 二核苷酸中的胞嘧啶被选择性地添加甲基, 形成5-甲基胞嘧啶的过程1。DNA甲基化作为表观遗传学最重要的现象之一，在基因表达调控，如基因沉默、异染色质化、转座子及病源分子防御、基因组印迹、转基因沉默和细胞分化等方面具有重要作用2。组蛋白修饰

35、作用包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、ADP核糖基化等3，这些修饰构成了丰富的“组蛋白密码”（Histone code），能影响染色质的压缩松紧程度，因此在基因表达中起着重要的调节作用4。染色质重塑是基因表达调控过程中所出现的一系列染色质结构变化的总称。染色质重塑主要包括3个方面，一是通过对突出于核小体核心结构之外的组蛋白氨基端尾巴的修饰影响染色质的结构和基因表达；二是SWISNF和有关的染色质重塑复合体利用ATPase和解旋酶活性来改变核小体在DNA上的位置；三是DNA的甲基化，即对CpG中的胞嘧啶进行甲基化修饰5。大量实验资料表明，来自双亲的同源染色体或等位基因在功能上存在差异；这种基于

36、不同来源（母源或父源）而导致同源染色体上等位基因或染色体上的同一功能区域在子代中表现不同表达活性的遗传现象称之为基因组“印记”。基因组印记是“后成修饰”（epigenetic modification）调控机制的一种，对哺乳动物生长发育，胚子形成及胚胎早起发育具有重要作用，甲基化在印记基因形成中发挥了重要作用，如小鼠甲基转移酶活性的缺失引起印记基因H19（Histocompatibility gene）、Igf2（Insulin-like growth factor type 2）和Igf2r（Insulin-like growth factor type 2 receptor）的异常表达6。

37、此外，基因组“印记”还与生物进化、性别决定、生长发育以及肿瘤发生有关。调控性的小分子RNA主要有miRNA、siRNA、piRNA（Piwi interacting RNA）、lncRNA（Long non-coding RNA）等。其各自特征如表1所示。表1 表观遗传学中起主要调控作用的非编码RNA种类长度（nt）来源主要功能siRNA21-25长双链RNA转录基因沉默miRNA21-25含发卡结构的pri-miRNA转录基因沉默piRNA24-31长单链前体或起始转录产物等多途径生殖细胞内转座子的沉默lncRNA>200多种途径基因组印记和X染色体失活 目前miRNA 和siRNA

38、的区别主要有两点:(1) miRNA 是内源性的, 而siRNA是外源性的,来源于病毒感染、转座子或转基因靶点。(2)miRNA 是由不完整的发卡状双链RNA, 经Drosha和Dicer 酶加工而成；siRNA 是由完全互补的长双链RNA, 经Dicer 酶剪切而成7。本文主要介绍基因组DNA甲基化在动植物中的发生机制和与组蛋白甲基化的关系并对甲基化研究技术以及甲基化研究应用做一简要综述。1 甲基化机制作为表观遗传学最重要的现象之一，DNA甲基化在调控自身基因表达，抵御外来入侵DNA、转座子元件及转基因沉默从而维持基因组稳定等方面具有重要作用。高等植物的细胞核DNA中大约20%40%的胞嘧啶

39、存在着甲基化修饰，这一比例要高于真菌和哺乳动物，而且植物中DNA甲基化主要发生在CpG和CpNpG对称序列上8，而动物中的甲基化主要发生在CpG二核苷酸序列上。1.1动物中DNA甲基化的机制在哺乳动物基因组中，DNA甲基化主要发生在胞嘧啶碱基（C）第5个碳原子上，由甲基转移酶将一个甲基基团共价结合于胞嘧啶5位碳原子形成5甲基胞嘧啶(5mC)，其中7080是以CpG二核苷酸的形式存在的9。目前，哺乳动物的DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase, Dnmt）发现有4 种, 分为两个家族: Dnmt1 和Dnmt3（Dnmt3a/b），另有一种Dnmt2, 主要为tRNA 的甲

40、基转移酶, 也有报导称Dnmt2具有微弱的DNA甲基转移酶活性10，它的缺失不能影响到完全的CpG甲基化和发育表型。 Dnmt1是1988年Bestor 等从真核生物克隆出来的第一个DNA甲基转移酶,一般认为，Dnmt1家族在DNA复制和修复中维持其甲基化；而Dnmt3a和Dnmt3b则催化CpG从头甲基化11。Dnmt3包括了两个从头甲基转移酶Dnmt3a、Dnmt3b和一个调节蛋白Dnmt3L。研究发现，哺乳动物在合子发育过程中，经历了一个去甲基化和重新甲基化的过程，哺乳动物成熟精子和卵母细胞的基因要比体细胞甲基化水平高12，在胚胎早起发育过程中，重新甲基化一旦建立，便可以稳定的遗传下去。

41、在对敲除了3种DNA甲基化转移酶小鼠模型的研究中发现，3种甲基化酶(DNMTl、DNMT3A、DNMT3B)，任何一种的缺失都将导致小鼠胚胎或围产期的死亡，从而可以看出DNA甲基化在正常的发育过程中是非常重要的13。一般认为DNA甲基化与基因沉默有关，而DNA去甲基化则与基因活化有关14。甲基化的DNA位点可以通过直接阻碍转录因子与甲基化的CpG岛结合, 而抑制基因表达15，也可以通过招募DNA甲基结合蛋白(Methyl-CpG-binding proteins,MBP)及一些阻碍复合物,阻止转录因子与特定DNA序列结合,间接抑制基因表达，如大鼠肝癌细胞中，DNMT1可以与MeCP2（Meth

42、yl-CpG binding protein 2）相互作用，结合于MT-1启动子区,抑制MT-1的表达16,在HeLa细胞中，DNMT3B可以与共抑制子SIN3A(Kinetochore associated protein)相互作用,协同KIF4A(Kinesin family member 4A)和condensin因子参与染色质浓缩17。有关去甲基化的机制在植物中研究的相对清楚，而在哺乳动物中却无明确的定论。已知哺乳动物中，DNA 主动去甲基化的途径可能有6种,即水解反应直接去除甲基团、核苷切除修复(NER)、碱基切除修复(BER)、5mC脱氨基化与BER偶联、5mC氧化去甲基化、延伸复

43、合物蛋白3(ELP3)催化的5mC甲基团脱氢18。不同细胞或组织中的去甲基化机制, 可能存在差异。1.2 植物中DNA甲基化的机制在植物中发现的胞嘧啶甲基转移酶类（CMTases，cytosine methyltransferases）一共有3类：域重排甲基转移酶DRM(Domains Rearranged Methyltransferase)，甲基转移酶MET (Methyltrans- ferase)和染色质域甲基转移酶CMT (Chromomethylase)19。其中，域重排甲基转移酶DRM家族与哺乳动物细胞中的甲基转移酶DNMT3家族同源，只在催化域的排列顺序上存在差异20。DRM通

44、过在某些特定的小分子RNA介导下或与某些调控因子（如AG04、RPDl等）相互作用在基因组DNA的从头甲基化过程中发挥作用。研究表明，当拟南芥METl基因因突变等因素而受损时，会导致基因组CpG位点的总体甲基化水平明显下降21，引起拟南芥生长发育障碍，说明植物中METl具有与哺乳动物中Dnmtl相似的保持CpG位点甲基化的作用。在植物中，CMT3(chromomethylase3)主要负责使CpNpG中的胞嘧啶发生甲基化。在cmt3突变的拟南芥个体中，CpNpG的甲基化水平显著的降低，同时还激活一个逆转座子亚类和SUP、PAI2基因的表达22。在植物多倍体化过程中，其基因组甲基化模式也会发生广

45、泛的改变，涉及的序列有低拷贝序列、重复序列(如反转座子)、启动子、rRNA基因、转录因子、抗病基因、代谢相关基因及细胞周期调控基因等23。在植物中,5mC转葡糖基酶(如DEMETER和类DEMETER蛋白)介导了包括印记基因在内的DNA主动去甲基化,沉默抑制因子（ROS1，Repressor of Silencing 1）通过阻碍siRNA介导的DNA甲基化和基因沉默作用，反向去除了DNA甲基化作用。ROSl具有DNA去甲基化机制中的多种酶活性，其转葡糖基酶活性移除5-甲基胞嘧啶碱基，继而AP(apurinic/apyrimidinic)裂解酶活性在脱碱基处切割DNA骨架，从DNA缺刻碱基位点

46、移除脱氧核糖，最终形成一个单腺苷缺口，此缺口在移除3'磷酸基后可以被磷酸酶和连接酶填平24。植物相对于动物来说，其基因表达更易受环境变化的影响，如高盐、干旱、低温、重金属胁迫等都会造成基因组甲基化的显著变化，在其不同发育阶段，不同组织甚至光照以及地理环境因素等都会对甲基化水平产生影响。所以，植物基因组DNA甲基化在基因表达调控，维持基因组稳定性等方面具有更重要的作用，其甲基化模式的改变会对植物的生长发育、代谢、花期、植株形态等产生重要影响25。但也有例外，植物5s rRNA基因，其序列中所有胞嘧啶甲基化的有无，都不会对其转录产生影响26。1.3 DNA甲基化与组蛋白甲基化的关系研究发现

47、，在拟南芥ddm1突变体中，DNA的甲基化水平比正常个体降低了7027。进一步研究表明，在ddm1突变体中，异染色质区组蛋白H3K9的甲基化水平降低而H3K4的甲基化水平升高28。上述试验结果表明，H3K9的甲基化与DNA的甲基化在基因的沉默机制中具有协同作用，而H3K4的甲基化拈抗DNA甲基化所产生的基因沉默。Tamaru和Selker研究发现，DIM-5（defective in methylation）的突变体中，DNA甲基化受到抑制，对DIM-5和组蛋白H3的体外共育及H3K9位的突变均表明,DIM-5所编码的具有SET结构域的蛋白具有催化组蛋白甲基化的功能，而这两种突变产生的影响相同

48、，由此他们推断，DNA的甲基化可能依赖于H3K9的甲基化29。在拟南芥中，Jackson等人研究发现，CMT3能与LHP1(HPl的同源物)作用并在LHPl的介导下使CpNpG发生甲基化，经过对LHPl和GST-CMT3进行“pull-down”分析，他们发现LHPl确能与CMT3结合，由此他们推测CpNpG甲基化的机制可能是H3K9的甲基化招募HPl与之结合，CMT3通过与LHP1的作用导致CpNpG的甲基化30。由此可见，CMT3的转甲基作用依赖于组蛋白H3K9的甲基化。然而，Fahrner等人在肿瘤细胞用5Aza-dC阻抑DNA甲基转移酶的活性时，首先发生的是CpG的去甲基化。接着基因被

49、激活表达，最后才出现组蛋白共价修饰的完全逆转，由此他们提出一种DNA甲基化与组蛋白甲基化之问新的作用模式。与以上的假设相反，组蛋白的甲基化需要在DNA甲基化的指导下才能完成31。Fuks等于2003年的试验结果似乎也证实并进一步丰富了这一假设，他们的试验结果显不，DNA甲基结合蛋白MeCP2的氮端还能与组蛋白甲基转移酶结合，从而指导H3K9发生甲基化32。这种方式为动物所特有，在植物中，DNA的甲基化好像并不能控制H3K9的甲基化33。综上所述，在不同物种中甲基化的调控机制可能不同，同一物种不用组织，不同发育时期，其甲基化调控模式也可能存在差别。1.4 甲基化DNA抑制基因转录沉默的机制前面我

50、们提到，甲基化DNA位点可以通过两条途径来抑制基因转录，一是直接阻碍转录因子与甲基化的CpG岛结合, 而抑制基因表达；二是通过招募DNA甲基结合蛋白(Methyl-CpG-binding proteins，MBP)及一些阻碍复合物,阻止转录因子与特定DNA序列结合,间接抑制基因表达。目前，在哺乳动物中发现有5种甲基化DNA结合蛋白，分别是MeCP2、MBD1、MBD2、MBD4和Kaiso蛋白。其中MeCP2（methyl-CpG binding protein 2）蛋白具有两个结构域，甲基化DNA结合结构域（methylated DNA-binding domain, MBD），识别5mCp

51、G位点34，另一个是转录抑制因子结构域（transcriptional-Repression domain,TRD），用于结合其他相关的转录抑制因子，如Sin3A、HDAC1/2等35。研究发现，MeCP2结合甲基化DNA位点以及抑制基因转录的作用是非常灵敏的，它只需与1个甲基化CpG位点结合就能发挥抑制转录的作用36。MBD1和MBD2结合于甲基化DNA位点，通过HDAC依赖的方式抑制基因转录，而MBD4并不具有抑制基因转录的功能,具有G/T错配糖基化酶的活性和5-甲基化胞嘧啶DNA糖基化酶的活性,因而起着DNA修复的作用37。同属MBD蛋白家族的MBD3同样含有保守的MBD基序，但却没有特

52、异性结合甲基化DNA的能力38，,它通过与MBD2相互作用并介导转录抑制复合体Mi2/NuRD(nucleosome- remodelling histione deacetylase)参与基因转录失活39。第5种是Kaiso，它不具备MBD基序,通过锌指基序结合甲基化的DNA(主要是CGCG),从而发挥作用40。这些结合蛋白与甲基化DNA位点结合后，会招募一些特定的抑制因子，形成转录抑制复合物，阻止转录因子与启动子区靶序列的结合,从而影响基因的转录。除此之外，一些非编码RNA（如siRNA）同样参与了RNA介导的DNA甲基化过程，哺乳动物X染色体失活就是由RNA介导的。X染色体失活特异转录基

53、因（X-chromosome inactivation specific transcript，Xist），位于X染色体失活中心（X-chromosome inactivation center，Xic）。在小鼠中，Xist转录物约为17kb，而人Xist转录物约为19kb，含6-7个外显子。早期胚胎2个Xist基因都具有活性,维持低水平的转录，随后一条X染色体上的Xist基因高表达生成非编码RNA,逐渐在自身X染色体周围簇集，RNA在核内与Xist基因结合，从而增加Xic与蛋白质的结合，并招募乙酰化、甲基化等相关蛋白引起Xic附近基因表达抑制，并且抑制作用向染色体远端传播，导致整条染色体失活

54、。表明，DNA甲基化并非导致了异染色质化，而是维持异了染色质化。2甲基化研究技术近些年，随着DNA甲基化研究的不断深入，DNA甲基化分析方法层出不穷，按其前期处理的不同，主要可分为：a限制性内切酶(restriction enzyme)法，限制性内切酶可以切割非甲基化的位点，而甲基化以后的识别位点将被保留，主要方法有MSRF、RLGS、AIMS、MSAP、McrBC酶切法、MCA-RDA、焦磷酸测序法等；b亚硫酸氧钠(sodium bisulfite)法，亚硫酸氢钠把非甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而保持甲基化的胞嘧啶不变，以此实现两类的分离，此方法因其准确率高被誉为裣测DNA甲基化的“金方法”

55、，在此基础上可以结合DNA直接测序、限制性内切酶分析、甲基化特异性PCR扩增、甲基化敏感的单核苷酸引物延伸法、高效液相色谱法以及锁式探针技术、DMH和MSO等方法测出相应序列的甲基化情况；c甲基化DNA免疲共沉淀(methyl-DNA immunoprecipitation，MeDIP)，MeDIP方法是用5-甲基胞嘧啶特异性抗体或者用含有甲基结合结构域的蛋白通过免疫沉淀富集基因组甲基化或未甲基化片段41。其基本程序是：(1)提取全基因组DNA，经超声波打断成长度为400一500 bp的片段；(2)加热变性，将变性的单链DNA样品平均分为两份；(3)其中一份加入甲基化DNA特异性抗体，另一份作

56、为Total input DNA样品；(4)使用亲和层析分离上一步样品中的甲基化DNA片段的抗体复台物，样品中其余的非甲基化DNA片段被洗脱，纯化得到甲基化DNA片段(MeDIP DNA)。得到纯化的甲基化DNA片段后可以结合荧光定量PCR技术定量检测DNA甲基化，也可结合芯片技术检测基因甲基化。各方法优缺点如表2和表3所示。下面，我们将主要介绍基于传统的限制性内切酶方法的甲基化敏感扩增多态性（methylation sensitive amplification polymorphism，MSAP）和目前刚建立的单分子实时测序法以及依赖于单分子纳米孔技术的测序法。表2 DNA甲基化实验检测技

57、术各种前期处理方法的特点处理方法分辨率优点缺点酶处理中等方法相对简单只能针对内切酶能识别的位点亚硫酸氢盐高（单个碱基）准确，可应用于任何待检测样品需要将所有非甲基化的胞嘧啶进行转换免疫沉淀中等任意序列背景下的甲基化胞嘧啶都能实现免疫沉淀对发生甲基化的胞嘧啶的密度要求高 表3 种表观基因组学研究方法的优缺点方法目前主要用途基因组DNA量优点缺点MSRF甲基化片段筛选100ng1g可检测全基因组所有CpG岛少量样本间的比较RLGS寻找差异甲基化位点15 g可检测全基因组CpG岛需要使用同位素，异常结果不易解释AIMS印记基因鉴定和差异甲基化片段筛选100ng1g可鉴定印记基因、检测全基因组CpG岛

58、基因组CpG位点的覆盖率有限MCA-RDA分离不同样本间差异甲基化片段5g可分离不同样本间差异甲基化片段不能同时比较多个样本，不能分离出差异的低甲基化片段LUMA特定位点和整体基因组甲基化水平位点分析200500ng耗时短、操作简单测序长度有限，价格昂贵Bisulfite sequencing特定位点甲基化水平检测500ng1g可精确检测每个CpG位点的甲基化状态需要大量的克隆测序，过程较为繁琐且价格昂贵DMH/MSO特定位点甲基化检测2g高通量只能检测已知序列ChIP-on-Chip整体基因组和特定位点甲基化检测110g高通量，可同时检测整个基因组和特定位点的甲基化状态价格昂贵MALDI-T

59、O-F-MS特定位点甲基化检测10ng1g高通量价格昂贵，主要用于特定位点检测2.1 甲基化敏感扩增多态性（methylation sensitive amplification polymorphism，MSAP）技术此方法是在扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)技术的基础上建立起来的42。其基本程序是：提取基因组DNA，根据Hpa、MspI两种酶对甲基化敏感程度不同。分别用EcoR IHpa、EcoR IMspI两组酶组合对基因组DNA进行双酶切，连上接头后，用按照接头序列设计的引物加上一个选择性碱基进行PCR扩增，称

60、为预扩增。预扩增产物稀释后，再加入另外两个选择性碱基引物进行第二次PCR扩增，称为选择性扩增。扩增产物变性后在6的PAGE胶上电泳，最后采用银染或同位素放射自显影方法处理PAGE胶，统计和分析DNA条带即可得出基因组cpG位点甲基化状态。还可以对差异扩增片段回收克隆测序，通过比对可鉴定甲基化差异位点。MSAP技术相对其他DNA甲基化测定技术有如下优点：不需知道被测DNA的序列信息；操作相对简便，在AFLP基础上可直接操作；可在全基因组范围检测CCGG位点的胞嘧啶甲基化变化。MSAP技术的局限性在于只能检测CCGG位点的胞嘧啶甲基化。此方法常用于研究动植物全基因组甲基化状态。2.2 单分子实时测

61、序法直接检测DNA甲基化(single-molecular real time sequencing，SMRT)SMRT是最新开发的方法，由Flusberg等43提出，本方法不需要亚硫酸盐处理，而利用DNA聚合酶进行边合成边收集荧光信号的方法进行测序。其原理是：DNA聚合酶催化荧光标记的核苷酸结合到核苷酸链上，当核苷酸掺入时，通过荧光脉冲到达和持续的时间检测可以获得聚合酶动力学信息，从而可以直接测定DNA模板上的核苷酸修饰，包括：N6-甲基腺嘌呤，5-甲基胞嘧啶，5-羟甲基化胞嘧啶。Pacific Biosciencs公司发明了一种直径只有几十纳米的纳米孔(zero-mode waveguid

62、es，ZMWs)，单分子的DNA聚合酶被固定在这个孔内。聚合酶链式反应开始时由于荧光标记的A、T、C和G较快速地从外面进入到孔内又出去，它们形成了较稳定的背景荧光信号。当这些荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA链的时候，它的荧光就同时能在DNA链上探测到。当它与DNA链形成化学键的时候，它的荧光基团就被DNA聚合酶切除，荧光消失。这种荧光标记的脱氧核苷酸不会影响DNA聚合酶的活性，并且在荧光被切除之后，合成的DNA链和天然的DNA链完全一样。2.3 依赖于单分子纳米孔技术的测序(single-molecule nanopore DNA sequencing)该方法由英国Oxford NanoPor

63、e Technologies的科学家在2010年初提出44，单分子纳米孔测序仪能直接分辨出未修饰的胞嘧啶和甲基化胞嘧啶。其原理是当核酸外切酶消化单链DNA后，单个碱基落入孔中，它们瞬间与环式糊精相互作用，并阻碍了穿过孔中的电流。每个碱基A、T、G、C以及甲基胞嘧啶都有自己特有的电流振幅，每个碱基也有特有的平均停留时间，它的解离速率常数是电压依赖的，+180 mV的电位能确保碱基从孔的另一侧离开，因此很容易转化成DNA序列。以往对甲基胞嘧啶进行测序，都要先进行重亚硫酸盐转化，纳米孔技术就能直接读出这第5种碱基。目前，纳米孔测序仅限于短的寡核苷酸。此外，Oxford Nanopore的测序仪仍面临

64、两个重要的技术问题：一是如何将核酸外切酶更好地附着在孔上，让它每次以正确的序列顺序只进入一个碱基，然后从另一侧离开，这是一个大挑战；另一个是并行化，这个问题可能简单一些，可以开发出一个芯片，上面有数万个孔，来确保整个测序过程更快速。不过，一旦成功。第5种碱基5mC的直接测序将会产生重大影响。3甲基化应用3.1 DNA甲基化在植物中的应用DNA甲基化在植物的生长发育过程中具有重要作用，甲基化水平的改变往往对植物造成不良影响。通过研究植物基因组甲基化水平，分离甲基化相关基因，探索植物生长、发育、代谢调控机制，揭示植物表观遗传调控机制，对植物的改良、育种具有重要意义。在植物基因组中，大量重复序列和转

65、座子元件被甲基化而维持基因组稳定45，甲基化也是植物抵御外源入侵病毒分子的有效机制，外源基因插入失活现象也有部分与甲基化有关。外源基因失活(Inactivation)或沉默(Silencing)现象是指表达的外源基因由于受到各种因素的影响，在转基因植株的当代或后代中受到了抑制。植物DNA甲基化引起外源基因失活的现象十分类似细菌的限制修饰系统，这一防御机制可以有效地识别出外来DNA序列。有研究发现，DNA甲基化易发生在外源基因启动子区CpG和CpNpG(N为任意碱基)位点的胞嘧啶残基上46。DNA甲基化作为直接导致外源基因失活的机制之一，在反式失活、共抑制及重复序列诱导的基因失活现象中又均有所涉

66、及。所以，通过研究甲基化机制可以更好的了解外源基因失活的分子发生水平，为转基因提供参考或开发更高效的转基因方法，或对植物进行分子修饰，使其对外源病毒分子具有更强的抵御机制，培育新种系。此外，甲基化作用被发现与植物的春花作用有关，春化作用可以有效的降低基因组甲基化胞嘧啶的水平，Burn等用5-azaC(5-氮胞苷)处理未春化的拟南芥植株，明显比对照植株开花提前，而对春化作用不敏感的晚开花的突变体对5-azaC处理却没有任何反应。这表明春化作用是通过去甲基化来解除开花的启动障碍的。许多研究表明，甲基化作用与植物的杂种优势也存在一定的关系47。DNA甲基化还可以用于开发分子标记48，研究植物遗传多样

67、性，进化关系，区分不同种质资源，揭示其遗传本质。3.2 DNA甲基化在动物中的应用DNA甲基化作为最基本的表观遗传修饰方式之一，在调控哺乳动物基因表达、细胞增殖、分化发育、基因组印记、肿瘤发生、X染色体失活等方面都起着重要作用。基因组甲基化模式发生改变常与某些遗传疾病、肿瘤的发生密切相关。在各种疾病的致病机制中，异常的甲基化模式是一个重要的致病原因。因此，甲基化对哺乳动物基因表达模式乃至基因组的稳定性都起着重要作用。目前，哺乳动物中甲基化的研究主要集中在肿瘤相关基因，疾病相关基因，分子标记开发以及细胞重编程等方面。甲基化水平的异常改变往往会对生物的生长发育产生不良影响，甚至恶性肿瘤的发生，如血

68、管内凝血及纤维蛋白溶解综合征(ICF)即是由于DNMT3B的突变导致1、9和16号染色体相关区域低甲基化而引起的49。基因组印记基因的不正常甲基化会致使印记基因的异常表达，导致疾病的发生，如PWS综合症（Prader-Willi syndrome）、AS综合症(Angelman syndrome)和孤独症等。所以，对人类基因组总体甲基化水平及特定基因甲基化状态的了解有助于对疾病的诊断和治疗。人类表观基因组协会(Human epigenome consortium，HEC)于2003年启动的人类表观基因组计划(Human epigenome project，HEP)，就是旨在绘制出人类基因组中甲

69、基化可变位点(Methylation variable positions，MVP)的图谱，即不同组织和疾病状态下，5-甲基胞嘧啶出现及分布频率的图谱，以系统地研究DNA甲基化在人类表观遗传、胚胎发育、基因组印记及肿瘤发生中的重要作用。研究发现，一些基因启动子甲基化状态的改变可能与心血管疾病的发生有关，有些心理疾病，如抑郁症等也可能涉及基因甲基化水平的变化，甚至学习和记忆的过程也涉及组蛋白修饰和DNA甲基化50。还通过对一些特定印记基因的甲基化检测，对胎儿进行产前诊断，从而了解胎儿的健康状况。Thorgeirsso于2007年对肝癌组织的研究发现，肝癌组织DNA甲基化水平明显低于癌旁和正常肝组

70、织。而Bibikova等人对结肠癌、乳腺癌、肺癌和前列腺癌细胞系以及正常细胞中371个基因中的l536个位点的甲基化状态进行聚类分析，发现了55个可以较好地区分癌细胞和正常细胞以及区分各种癌细胞类型的位点51，该方法表明，各种癌症都存在其特异的DNA甲基化生物标记，利用此标记可用于癌症发生的早期预测，为癌症治疗提供新的途径。除了利用甲基化标记发现潜在的有价值的医学位点外，独特的甲基化分子标记也被用来鉴定同卵双生或多生子的甄别、鉴定，是对经典的遗传标记SNP、STR等的有效补充。在衰老细胞中，p16INK4a 的表达水平是年轻细胞中的1020 倍,是细胞衰老的主导基因52，而许多研究也已表明甲基

71、化水平会随着细胞的衰老而降低，表明甲基化的研究对揭示细胞衰老机制有重要指导意义。4展望表观遗传学与动植物的生长发育密切相关，对表观遗传学现象的分子研究将会揭示更多的遗传发育机理，有助于我们更多的了解动植物资源，在基因表达与调控、疾病防御、动植物分子育种、人类疾病防治等方面有重要作用。甲基化作为最重要的表观遗传学现象之一，对动植物基因表达调控有着不可忽视的作用，其与组蛋白、非编码RNA以及其他调控因子的相互作用也存在复杂的相互关系，随着高通量甲基化检测技术体系的开发建立，人们对基因组甲基化必然会有更加深入的认识，从而揭示更多复杂生命现象的本质。参考文献：1 Bird A. DNA methyla

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