核酸和核仁组织区的组织化学

1、核酸和核仁组织区的组织化学 核酸的分布与组成成分 核酸的分布:细胞质细胞核染色质核仁核酸多核苷酸单核苷酸磷酸戊糖：核糖或脱氧核糖 核苷碱基：A， T， C， G， U 核酸的种类与染色应用RNA：胞质及核内戊糖：核糖腺嘌呤（A），鸟嘌呤（G），胞嘧啶（C），尿嘧啶（U）DNA：核内戊糖：脱氧核糖腺嘌呤（A），鸟嘌呤（G），胞嘧啶（C）， 胸腺嘧啶（T）核酸的种类与染色应用核酸染色应用免疫性疾病的诊断与研究免疫缺损AID过敏性反应肿瘤的诊断与研究淋巴瘤反应性病变瘤样病变核酸的染色方法1，Feulgen法2，甲基绿-派洛宁法Feulgen-Rossenbeck法原理：脱氧核糖核酸脱氧戊糖与碱基断开

2、，戊糖端形成醛基（CHO-CHO）与Schiff试剂（无色）反应紫红色（DNA部位）PAS法:用过碘酸强氧化剂使六碳糖中的1,2乙二醇基（CHOH-CHOH）变成二醛基（CHO）然后与Schiff试剂反应，形成紫红色的化合物，在有多糖的部位，就会呈现紫红色阳性反应。原理Schiff试剂中的酸浓度对两个反应的效果不同1 / 7pH在30和42: 对Feulgen反应染色好pH24: 适宜于作PAS反应 Schiff试剂置于棕色瓶，放冰箱，染色效果好，保存时间长 HCL水解 作用：嘌呤碱基的去除，醛基暴露，醛基与Schiff试剂以共价键结合 ，一种特殊的细胞化学反应（染色强度增加）核内DNA产生游

3、离醛基成为无嘌呤核酸(APA) 和将大分子APA解聚成小片断游离出细胞核，被HCL溶解（染色强度减弱）注意事项：1.水解时间 60 1N HCL 固定液Carnoy 8min Zenker 5min Formalin 8min 无水乙醇 5min Bouin 不能用2.固定液组织块用Carnoy,涂片用甲醇3.预实验经典的Feulgen法是用1N HCL 60中水解。 改良的方法是5N HCL室温下进行或605分 钟。试剂配制1.schiff氏试剂 ：清而透明的浅黄色，0-5保存。粉红色的弃之。2.亚硫酸水(洗涤剂) 3.5N HCl(水解用) (改良法）4. 1%亮绿 染色步骤1.

4、 切片脱蜡至水、蒸馏水2. 5N  HCl 60 5min或室温20-40min  3. 蒸馏水洗  （使水解停止）4.  Schiff试剂中染色60min 室温5. 用0.5%亚硫酸盐溶液洗35次(以洗去多余的非特异性色素及扩散染料)6. 流水冲洗5 min  7. 蒸馏水洗 8. 1%亮绿复染2min 9. 蒸馏水洗10. 脱水、透明、封片实 验 结 果 1. 细胞核中的DNA呈鲜亮的紫红色反应2. 细胞质被亮绿复染成绿色应用Feulgen法的产物与DNA的含量呈正相关，主要用来检

5、测产物定量DNA，测细胞的倍体数（多倍体、异倍体）用于肿瘤细胞和精子的定量分析。甲基绿-派洛宁法methyl green-pyronin甲基绿派洛宁为碱性染料，它分别能与细胞内的DNA、RNA结合呈现不同颜色。甲基绿与派洛宁作为混合染料甲基绿与染色质中DNA选择性结合显示绿色或蓝色；派洛宁与核仁、细胞质中的RNA选择性结合显示红色 甲基绿-派洛宁染色机制电离作用电离后甲基绿在五价氮处产生二个正电荷，碱性较强，与细胞核结合，派洛宁电离后仅产生一个正电荷较弱与胞质结合聚合作用 甲基绿与高聚合的DNA结合，派洛宁与聚合低的RNA结合甲基绿-派洛宁法methyl green-pyronin染色步骤：

6、1切片脱蜡如常，水洗 202M醋酸缓冲液稍洗 3甲基绿派洛宁液染色12小时 4倾去染液，用滤纸吸干切片上多余水分 5用正丁醇迅速分化1020秒 6经丙酮迅速脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。结果：DNA呈绿色，RNA呈红色。甲基绿-派洛宁法methyl green-pyronin2%甲基绿储存液：甲基绿 2g， dd H 2 O 100ml2%派洛宁储存液：派洛宁2g， dd H 2 O 100ml甲基绿用氯仿抽提5-6次分液漏斗，加等量氯仿充分摇荡数分钟后静置液体分层，放掉分液漏斗中下层的紫色氯仿直至氯仿洗不下紫色为止派洛宁用氯仿抽提5-6次同上用氯仿抽提数次，待氯仿不显红色为止工作液： 2%

7、甲基绿储存液（抽提后） 9ml2%派洛宁储存液 4ml用0.2M醋酸盐缓冲液（pH 4.8） 调PH到4.8甲基绿-派洛宁法methyl green-pyronin注意事项： 1新鲜组织染色效果较好，应尽早选取新鲜组织固定。 2以Carnoy氏液固定的组织最为理想。4，2-4小时，超过一天则染色效果不理想 3甲基绿派洛宁染液的pH值必须严格控制。PH4.8时，甲基绿与派洛宁分别对DNA和RNA有亲和性，可获较好结果PH9时，甲基绿着色，派洛宁不着色。PH极低时，甲基绿不着色甲基绿-派洛宁法methyl green-pyronin注意事项：4配制染液时一定要抽提，一般用氯仿。抽提甲基紫及结晶紫

8、5甲基绿派洛宁法染色后的分化是关键的一步，分化时间的掌握很重要，丙酮中带水会影响分化必须注意。甲基绿-派洛宁法methyl green-pyronin应用：用于免疫系统疾病的诊断和研究。如免疫缺陷、自身免疫病、过敏反应等疾病用显示核酸的染色方法，可观察到其DNA和RNA的含量及分布有无异常。用于免疫母细胞的判断，免疫母细胞瘤和组织细胞瘤的鉴别，免疫母细胞性淋巴结病的诊断等。对肝细胞和神经细胞的研究也具有较高的价值。甲基绿派洛宁染色×原 位 末 端 标 记 技 术 运用末端脱氧核苷酸转移酶（Terminal deoxynucleotidyl transferase TdT）介导的荧光素

9、dUTP缺口末端标记法（TdT-mediated-dUTP nick end labelling, TUNEL）检测DNA裂解，细胞凋亡。原 位 末 端 标 记 技 术原理： 以TdT酶和核苷酸混合形成标记一抗，以羊Fab片断偶联抗荧光素抗体和标以碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶为标记形成二抗，再用底物显色。 原 位 末 端 标 记 技 术试剂： 1末端脱氧核苷酸转移酶 2核苷酸混合液（包括dATP、dCTP、 dGTP、dUTP带荧光） 3抗荧光素标记（相当于二抗 带AP/POD）原 位 末 端 标 记 技 术步骤： 1石蜡切片脱蜡到水、蒸馏水洗 2蛋白酶K消化1030ug/ml 37 30分钟

10、3TBS洗 pH 7.5 4加TUNEL反应液（试剂1+2 使用前按比例混合）50ul/张 37 60分钟 5TBS洗 , Buffer A洗 6加抗荧光素标记（带AP）50ul/张 37 30分钟 7Buffer A洗后，Buffer B Buffer C pH9.5 各洗3次 8NBT +BCIP显色 9水洗、核固红复染 10脱水、透明、封片原 位 末 端 标 记 技 术标记结果： 阳性 定位于核内 深蓝色 阴性 不加酶溶液，仅加核苷酸混合液 不显色原 位 末 端 标 记 技 术注意事项：1标记切片以近期内制作为好，用左旋多聚赖氨酸作防脱片处理。2实验器皿应尽可能消毒或高压灭菌3蛋白酶K浓

11、度可根据不同组织作预实验4滴加各种反应液后严防切片干燥5充分漂洗核仁形成区嗜银染色国内外病理学家将细胞核仁组织区嗜银染色技术运用于肿瘤病理学的诊断和研究。该技术对区别良恶性病变及对肿瘤进行分型分级等有重要价值。 核仁组成区的部位人类近端着丝点染色体短臂次缢痕区域。由核糖体基因rDNA 盘聚在染色体特殊部位，(NOR)检测方法：银染技术是显示NORs有效方法之一简便 银与NORAPs结合，NORAPs是一种分子量为100000酸性非组蛋白，主要定位于核仁中。银染反应过程：1核晶过程。银颗粒已沉积在核仁反应部位，但光镜下未见到。2光镜下出现黑色颗粒。银离子颗粒在NORAPs上通过碳氧基与硫氢基而形

12、成。NORAPs含许多羧基，对银染重要。二硫键，巯基。实验注意事项固定剂选择：染色强度 固定液 甲醛汞 甲醛汞 10%甲醛 10%缓冲中性甲醛 Helly 2.5%戊二醛 10%甲醛乙酸 10%甲醛钙 Zenker 多聚甲醛 Bouin Carnoy 汞：与SH亲和力大，影响银离子结合酒精类固定剂效果最佳，它可使蛋白链向外旋转，如三级或四级结构被分裂，为SH键及SS提供吸收Ag机会。水的选用：水质纯，选用ddH2O或去离子水水质不佳，残余cl-, 使Ag+的沉淀出来。切片：m且厚薄均匀m不能包含整个细胞，会漏掉一些AgNOR颗粒。厚薄不均会出现AgNOR颗粒重叠现象。硝酸银不能含有杂质胶质银工

13、作液新鲜配制，用前过滤。染色注意避光温度不能超过（不能低于）染色时间精确，预实验。脱水，透明，封片，严格操作，以防污染颗粒。试剂配制AgNOR染色液甲液：明胶粉g溶于ddH2O至ml，宜在，使之溶解，再加纯甲酸ml。乙液：硝酸银g溶于ddH2O至ml， 溶解后置于冰箱中。AgNOR工作液取甲液ml，乙液ml，临用时配制。染色步骤：连续石蜡切片m，切片常规脱蜡至去离子水水化。AgNOR工作液（，暗处进行），滴加至覆盖切片表面，分钟为宜，分钟以后不断显微镜观察。流水充分冲洗切片。对比染色。常规脱水、透明、封片。结果AgNOR颗粒为深棕色。记数方法AgNOR计数对区别良恶性病变是有价值的，但由于计数

14、方法不统一，各实验室报导数值相差很大。每例涂片至少计数个细胞，切片至少细胞，计数细胞内每一个可辨别的颗粒。直径m 团块或颗粒按个颗粒计数。最后按单位细胞核内AgNOR数计算。除计数外需注明形态分型。颗粒形态分类一般有种形态学类型，AgNOR形态分型与计数同样重要，特别在良恶性之间，细胞增生活跃，更应注意形态类型。颗粒形态分类单一型：直径m，以m为多见，境界清，边缘光滑，圆形颗粒，相当于核仁本身。颗粒形态分类弥散型：核质内散在分布大小不一的颗粒，数目多达个，圆点状，条块状，不规则型。颗粒形态分类聚集型：核质内散在分布大小不一的颗粒，颗粒呈团块、条索、不规则型，此型在恶性肿瘤只常见。核仁内型：胞核内有个或数个核仁，核仁大小不一，大者可达m，核仁周边常有空晕，每个核仁内有境界清晰或不清晰颗粒，数量不等，恶性肿瘤中常见，在增殖的细胞中也可见到。颗粒形态分类混合型：除）外，其余三型均可混合，以弥散型及核仁内型混合最为常见。鉴别诊断良性病变单一型较多良性病变中一般不见单独的核仁内型与聚集型恶性肿瘤弥散型发生率高混合型在良恶性病变中无差别良性病变一