鱼类细菌性败血症检疫技术规范

1、鱼类细菌性败血症检疫技术规范目次前言1 范围12 规范性引用文件13 检样质量要求14 检疫方法14.1群体检疫14.2流行病学调查14.3解剖检查14.4 病原分离鉴定14.5 免疫学检验2附录A（规范性附录）流行病学调查3附录B （规范性附录）气单胞菌属鉴定用培养基4附录C （规范性附录）间接荧光抗体法5附录D（规范性附录）SPA菌 诊断液的制备6前 言本标准的附录A、附录B、附录C、附录D均为规范性附录。本标准由湖南省畜牧水产局提出并归口。本标准起草单位：湖南农业大学动物科学技术学院、湖南省水生动物防疫检疫站。本标准主要起草人：肖克宇、肖光明、江 辉、江为民、戴振炎、何艳林、钟 蕾。1范

2、围本标准规定了鱼类细菌性败血症(Bacterial septicemia of fresh-water fishes )的检样质量要求及检疫方法。本标准适用于我省鱼类细菌性败血症的检疫。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T18652-2002 致病性嗜水气单胞菌检验方法3检样质量要求取被检病鱼10尾，要求材料新鲜无污染，病变具有代表性。4 检疫方法4.1群

3、体检疫仔细检查鱼群有无异常表征，如发现被检疫鱼厌食或不吃食，静止不动或发生阵发性乱游、乱窜，或者在池边摩擦，最后衰竭而死，死鱼有明显的出血症状，可视为疑似鱼类细菌性败血症。4.2流行病学调查 对疑似鱼类细菌性败血症，应进行鱼类细菌性败血症流行病学调查。调查按附录A的要求执行。4.3解剖检查 病鱼出现以下症状，可进一步判定为疑似鱼类细菌性败血症。疾病早期及急性感染时，病鱼的上下颌、口腔、鳃盖、眼晴、鳍基及鱼体两侧轻度充血，肠内尚有少量食物；严重时鱼体表严重充血，以至出血（内出血），眼眶周围也充血（尤以鲢鱼、鳙鱼为甚），眼球突出，肛门红肿，腹部膨大，腹腔内积有淡黄色透明腹水，或红色浑浊腹水；病鱼鳃

4、、肝、肾的颜色均较淡，呈花斑状，严重贫血；病鱼肝脏、脾脏、肾脏肿大，脾呈紫黑色；病鱼胆囊大，肠系膜、腹膜及肠壁充血，肠内没有食物，而有很多粘液，有的肠腔内积水哐有气，肠被胀得很粗；有的病鱼鳞片竖起，肌肉充血，鳔壁充血（尤其是鳔的后室），鳃丝末端腐烂。4.4病原分离鉴定准备.1设备和器械无菌室、显微镜(具油镜、暗视野)、恒温培养箱、接种环、培养皿等。.2培养基各种培养基的制备方法按附录B的要求执行。病原菌分离.1检样质量要求检样要求同第4章。.2取样用干净纱布擦去检样鱼体表水分与粘液，用75%酒精棉球擦拭，立即用燃烧的酒精棉球烧灼体表，或将鱼体置无菌室紫外灯下照射30min，即可取各部位样品接种

5、培养基。.3划线接种将取了样的接种环划线接种于培养基。.4分离培养将划线接种的培养基置28恒温培养24h，取单个菌落，用于鉴定。病原菌鉴定鱼类细菌性败血症病原主要为嗜水气单胞菌和温和气单胞菌。两种菌的形态、生理生化性状与致病性的鉴定方法按GB/T18652-2002的要求进行。温和气单胞菌和嗜水气单单胞菌均属气单胞菌属，其形态、理化特性基本相同，主要应进行生化性状差异性鉴别试验，其区别指标如表1。表1嗜水气单胞菌和温和气单胞菌主要特性区别区别项目嗜水气单单胞菌温和气单胞菌七叶苷+-KCN肉汤+-利用组氨基和精氨酸+-阿拉伯糖+-水杨苷+-蔗糖+-VP+不定注：从病鱼分离到嗜水气单胞菌或温和气单

6、胞菌，可确诊为鱼类细菌性败血症。4.5免疫学检验 经4.1、4.2、4.3条判定为疑似鱼类细菌性败血症的病鱼进行病原分离后，可用下列方法之一进行病原免疫学检验，可确诊鱼类细菌性败血症。间接荧光抗体法，方法如附录C所示。SPA -CoA 检测法.1加诊断液与待测菌混合取干净载玻片一张，在上面一端适当位置加SPA诊 断液1滴，另一端加1滴阴性SPA菌 液。SPA诊断液和阴性SPA菌 液的制备方法见附录D。.2待测菌与诊断液混合用接种环取条分离的待检菌落少许分别与载玻片上的两液滴轻轻混合，先与阴性SPA菌液接触混合，待接种环经火焰灭菌后再取菌落与S PA诊断液混合，经（13 ）min 即可观察结果。

7、.3结果判定如果菌落与SPA诊 断液出现清晰可见的凝集颗粒，呈阳性反应，菌落与阴性SPA菌 液没有出现此凝集颗粒，呈阴性反性，则可判定待鉴定菌为嗜水气单胞菌或温和气单胞菌。阳性病鱼可判断为鱼类细菌性败血症。附录A（规范性附录）流行病学调查流行病学调查如表A.1所示。表A.1流行病学调查调查内容流行病学情况判断与诊断水质池塘水质好，经常消毒，很少暴发鱼类细菌性败血症。池塘水质差，又长时间未对养殖水体消毒，发生鱼类细菌性败血症的可能性较大。水温水温在（936）时都可以发生细菌性败血症流行，当水温持续在28以上或者高温季节后水温仍保持在25以上时，易暴发流行。 高温季节，当养殖鱼类出现典型出血症状，

8、可初步判断为鱼类细菌性败血症。当水温在20以下或33以上时，鲫鱼、鲢鱼、鳙鱼等养殖鱼类出现典型出血症状时，可初步判断为鱼类细菌性败血症。免疫接种是否注射了草鱼出血病疫苗，免疫是否合格。注射了草鱼出血病疫苗，免疫合格，当草鱼、青鱼出现典型出血症状时，可初步判断为鱼类细菌性败血症，初步排除草鱼出血病。患病鱼种类 几乎所有养殖鱼类都可以发生细菌性败血症。如果除草鱼、青鱼外，鲫鱼、鲢鱼、鳙鱼等其他养殖鱼类都出现典型出血症状时，可初步判断为鱼类细菌性败血症。如果只有草鱼、青鱼有典型出血症状，同池的鲫鱼、鲢鱼、鳙鱼等其他养殖鱼类未发病，可初步排除鱼类细菌性败血症。患病鱼年龄鱼种和成鱼都可以发生细菌性败血症

9、。如果除草鱼、青鱼、鲫鱼、鲢鱼、鳙鱼等养殖鱼类的鱼种和成鱼，特别是二龄以上草鱼都出现典型出血症状时，可初步判断为鱼类细菌性败血症。如果只有二龄以下草鱼种，特别是当年和一龄草鱼种出现典型出血症状，可初步排除鱼类细菌性败血症。鱼病防治是否使用消毒药物进行鱼病的防治。患病鱼出现典型出血症状，使用消毒药物防治效果好，可初步判断为鱼类细菌性败血症。如果多次使用消毒药物防治，病情不见好转，可初步排除鱼类细菌性败血症。 疫区划分根据水产养殖病害测报结果，确定产地是否疫区。如果产地是鱼类细菌性败血症疫区，患病鱼出现典型出血症状，则鱼类细菌性败血症的可能性大；如果是非疫区, 鱼类细菌性败血症的可能性相对要小。附

10、录B（规范性附录）气单胞菌属鉴定用培养基B.1普通肉汤取牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、氯化钠（NaCL）5.0g、磷酸二氢钾（KH2PO4）1.0g、蒸馏水 1000ml，混匀，加热溶解，调pH至7.6后分装，在112kPa条件下高压灭菌15min。B.2普通琼脂平板取牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、氯化钠（NaCL）5.0g、磷酸二氢钾（KH2PO4）1.0g、琼脂15.0g、蒸馏水1000ml，混匀，加热溶解，调pH至7.6后分装，在112kPa条件下高压灭菌15min，冷却至45时倾注灭菌平板。B.3RS琼脂平板取L-盐酸鸟氨酸6.5g、L-盐酸赖氨酸5.0g、L-盐酸半胱氨酸0.

11、3g、麦芽糖3.5g、硫代硫酸钠6.8g、溴麝香草酚兰0.03g、枸橼酸铁胺0.8g、脱氧胆酸钠1.0g、氯化钠（NaCL）5.0g、酵母提取物3.0g、新生霉素0.005g、琼脂、13.5g、蒸馏水1000ml，混合溶解，调pH至7.0，煮沸1min，待冷却至45时，倾注灭菌平板。附录C（规范性附录）间接荧光抗体法C.1培养菌标本片制作将条方法分离的待检菌株分别接种于肉汤培养基，在28条件下培养48 h 后, 加入最终浓度为0.15% 的福尔马林，于37处放置（2448）h 灭活，然后加PBS缓冲液，以5000 r/min离心10min，洗净3 次, 将细菌浓度调至20g/L 后, 涂片、风

12、干、火焰固定。C.2抗病原菌抗体制作以嗜水气单胞菌和温和气单胞菌的标淮菌株分别免疫家兔，按附录C的C.4条方法制备高免血清，再用Na2SO4 沉淀血清, 过DEAT纤维素, 收集蛋白峰。C.3滴加抗体用PBS将嗜水气单胞菌和温和气单胞菌的抗体分别进行(50500)倍稀释后滴加在C.1条方法制备的培养菌涂片上。C.4抗原抗体反应在室温下于保湿盒中反应30 min。C.5滴加FITC 标记的羊抗兔IgG用PBS洗玻片, 滴加PBS稀释10倍的F ITC标记的羊抗兔IgG (华美生物公司) , 再于室温下反应30min。C6荧光显微镜观察及结果判定用PBS冲洗玻片，以落射荧光显微镜(日本光学，BH-

13、2型)观察，与500倍稀释的一抗反应后再与二抗反应呈现清晰可见荧光者判为阳性。阳性病鱼可判断为鱼类细菌性败血症。附录D（规范性附录）SPA菌诊断液的制备D.1 制备SPA菌诊断液的材料 菌种为金黄色葡萄球菌国际标准菌株Cow an(含A 蛋白)。培养基由蛋白胨10g、萄葡糖1g、氯化钠3g、Na2HPO4·12H2O2g、牛肉膏5g、蒸馏水1000ml混合溶解，调pH至7.8而成，再用固体培养基加琼脂25g，在112kPa条件下高压灭菌15min。取Cow an菌种接种在上述液体培养基内，经37培养（1824）h，再转种在固体培养基上，使菌液布满整个表面，再经37培养（18-20）h

14、。用灭菌生理盐水洗下菌苔，以3000r/min离心15min，弃去上清液，再用灭菌生理盐水将菌沉淀悬浮后离心，如此反复洗涤菌体两次，然后用含0.5%福尔马林的0.01mol/L，pH值7.4的PBS制成10%的菌悬液（V/V），于室温放置3h或过夜。再将上述菌悬液于56（或80）水浴中加热30min，迅速冷却后，再用PBS洗涤离心3次，再用pH值7.4的PBS制成10%的菌悬液（V/V），于4冰箱保存。取健康成年雄兔体重(2.02.5)kg，每只家兔取甲醛灭活的嗜水气单胞菌或温和气单胞菌抗原1mg，用（12）ml PBS或生理盐水稀释，加等体积CFA充分乳化后，于家兔背部及后腿肌肉、皮下多点注射。第一次免疫后间隔(12)周，再以相同抗原lmg/ml加等体积IFA乳化后注入后腿肌肉或背部皮下多点加强免疫。尔后每隔(23)周按第二次免疫法重复加强免疫。每次免疫后(714)d抽取少许静脉血，分离血清，以备检测免疫效果。于第4次免疫后(57)d试血，用试管凝集试验测其效价, 凝集价达11280 以上者, 颈动脉放血分离血清于20保存。D.2 SPA菌诊断液的制备取上述已制备的SPA菌稳定液1ml，离心弃上清，再用PBS洗菌体(12)次，最后用PBS恢复至1ml，悬浮菌体，然后取上述高免血清0.1ml在56水浴中作用30min后，与前1ml悬浮菌