牙髓干细胞在再生医学中的应用研究与进展

1、牙髓干细胞在再生医学中的应用研究与进展马干洋1，郭晓班2(都医科大学附属北京口腔医院，北京市100050；2首都医科大学基础医学实验教学中心，北京市100069) 引用本文：马子洋,郭晓选.牙髓T细胞在再生医学中的应用研窕与进展出中国组织工程研究,2016. 20(19):28722878.文章快速阅读:DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.19.020 ORCID: 0000-0001 -6676-4095(11)马子洋，男，1995年生， 北京市人，汉族，首都医 科大学13级七年制口腔 医学专业在读。通讯作者郭晓/，博士 , 副教授，首都医科大学基 础医学实

2、验教学中心，北 京市100069中图分类号:R318 文献标识码:A文理编号：2095<344(2016)1902872-07稿件«受：2016-03-20文题释义：牙髓干细胞：来源于牙彼腔内的软组织，可自我更新，有着较强的克隆形成能力，与骨髓间充质干细胞 有极其相似的免疫表型(CD1O5+/CD73"CD347CD45):牙髓干细胞具有多向分化的潜能，在特定条件 下能够分化为骨、软骨、神经样细胞、肌细胞等类型。牙髓干细胞的转化医学研究意义：牙筋干细胞具有来源丰富、采集方便、免疫原性低、无伦理争议等优 点，因此，牙物干细胞在再生医学和组织I：程修熨中有着广泛的应用前景

3、。牙髓干细胞在骨组织修红领 域已进入临床研究阶段,而向其他组织分化的研究尚处于起步阶段或基础研究阶段，其调控机制存在着 诸多问题，有着巨大的研究潜力。摘要背景：牙他干细胞是具有良好分化与增殖能力的干细胞，因其取材方便,具有多向分化潜能等特征正逐 渐为再生医学研究领域重视。目的：通过分析整理国内外牙髓干细胞的研究进展，对其目前在再生医学领域的应用研究加以总结，为 进一步研究提供线索和方向。方法：以 44dental pulp stem cell, regenerative medicine, tissue engineering n 为英文检索词，以“牙野 干细胞，再生医学,组织工程”为中文检索

4、词，由第一作者检索Medline, PubMed,万方，维普，中 国知网数据库2000至2015年牙惆干细胞及再生医学相关文献，经过筛选最终获得46篇文献进行综述。 结果与结论：牙髓干细胞具有自我更新与多向分化潜能，获取方法筒便.在再生医学领域拥有巨大发展 潜能。牙临干细胞在骨组织修身领域已进入临床研究阶段，在向其他组织分化方向的研究,尚处于起步 阶段或基础研窕阶段，有待进一步研究拓展。关键词：干细胞:分化:牙髓干细胞:再生医学:分离:储存:成骨分化:成神经分化:血管生成：心肌细胞形 成主题词：干细胞:牙髓:再生医学:组织工程Ma Zi-yang. Studying forDental pul

5、p stem cells in regenerative medicine: application and developmentmaster's degree. BeijingStomatological Hospital, Capital Medical University. Beijing 100050. ChinaMa Zi-yang1, Guo Xiao-xia2 (1 Beijing Stomatological Hospital, Capital Medical University, Beijing 100050, China; 2 Experimental Cen

6、ter for Basic Medical Teaching, Capital Medical University, Beijing 100069, China)Corresponding author: Guo Xiao-xia, M.D. Associate professor. Experimental Center for Basic Medical Teaching. Capital Medical University. Beijing 100069. ChinaAbstractBACKGROUND: Dental pulp stem cells are characterize

7、d by multi-lineage differentiation and proliferation abilities and are easy to obtain; so they are becoming an issue of concern in regenerative medicine. OBJECTIVE: To provide clues and direction for further study by analyzing progress of domestic and overseas research on dental pulp stem cells, and

8、 summarizing their application in regenerative medicine. METHODS: The "dental pulp stem cell, regenerative medicine, tissue engineering* in Chinese and English served as the search terms to search articles related to dental pulp stem cells and regenerative medicine, published from 2000 to 2015

9、in Medline, PubMed, CNKI, Wanfang and Cqvip databases. Totally 46 articles were selected for overview.RESULTS AND CONCLUSION: Dental pulp stem cells, which hold the capacity of self-renewal and multi-lineage differentiation, are relatively easy to obtain, and exhibit a great potential in regenerativ

10、e medicine. The research of dental pulp stem cells in repairing bone defects has entered the clinical trial phase, but the research of cell differentiation into other tissues is still in basic trial phase and needs further development.Subject headings: Stem Cells; Dental Pulp; Regenerative Medicine;

11、 Tissue EngineeringCite this article: Ma ZY. Guo XX. Dental pulp stem cells in regenerative medicine: application and development. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016:20(19):2872-2878.0 弓| 言 Introduction干细胞是未充分分化的细胞，具有自我更新与分 化为特定组织器官的能力。1909年，Maksimov首次在 研究中发现造血干细胞，并提出"干细胞"的概念。 近年来，干细胞在再

12、生医学领域的应用研究越来越受 到研究者的重视。再生医学是指应用生物学及组织工 程学的理论方法，通过干细胞的增殖分化替代损坏的 细胞、组织和器官，使其具备正常组织、器官的结构 和功能。再生医学的应用研究能在一定程度上解决捐 献器官缺乏的问题。牙髓干细胞(dental pulp stem cell, DPSC)是指牙髓内可以快速增殖并且具有一定 克隆形成能力的牙髓细胞，由Gronthos等于2000 年首次提出，它具有与骨髓间充质干细胞相似的免疫 表型。牙髓干细胞可以在不同培养环境下表达4种多 能标记物:Oct-4、Lin-28、Sox-2、NANOG。牙 髓干细胞主要从脱落的乳牙、智齿、正畸牙等

13、中获得, 其来源丰富，不涉及到伦理问题，故在再生医学领域 的应用前景广阔。文章就牙髓干细胞在再生医学中的 研究进展做一综述。1 资料和方法 Data and methods1.1 文献检索和筛选要求1.1.1 检索数据库 中国期刊全文数据库(万方、 CNKk维普)、美国医学索引(Medline)、PubMed。1.1.2检索数据库的选择理由中国期刊全文数据库(万方、CNKk维普)是国内的大型中文学术期刊全文:库，收录范围广泛,特别是医学类期刊文献,读者很容易对研究内容进行检索并获得全文，便于浏览学习。PubMed免费提供生物医学方面的医学文献 搜索以及摘要，并提供全文来源数据库的连接，方便 查

14、找全文。美国医学索引(Medline)是国际性综合 生物医学信息书目数据库，是当前国际上最权威的生物医学文献:库，学校购买了西文生物医学期刊文库供教师和学生查找全文。1.1.3检索途径、检索词及各检索词的逻辑关系 为 全面、准确地检索出撰写该综述的相关文献，文章写 作过程中综合考虑了检索途径的选择、检索词的选择 和各检索词间逻辑关系的配置，制定了科学的检索策 略。检索途径:主题词检索、关键词检索、全文检索。检奏河:以牙髓干细胞，再生医学，组织工程； dental pulp stem cell, regenerative medicine, tissue engineering”为检索词。检索词

15、的逻辑组配:(dental pulp stem cell AND regenerative medicine) OR (dental pulp stem cell AND tissue engineering)。检索途径、检索词、检索词的逻辑组配的确定理由:方便寻找主要论述牙髓干细胞和再生医学的文献，或牙髓干细胞用于组织工程领域的文献。检点的时间范围：2000年1月至2015年10月。1.2文献筛选流程和筛选标准文献筛选流程：按照图1的步骤进行。图1文献筛选流程文献的筛选标准：文献内容与牙髓干细颗口再生 医学空切相关，且在权威期刊上已经发表的文献。文献的筛选标准的制定理由:为保障综述内容观 点

16、相关性强、新颖、明确，论据、结果、结论可靠。郁隙的文就：初检获得文献197篇，由全体作者 共同对检索文献进行评估，排除文献151篇，最终纳 入46篇文献进行综述。排除理由:重复研究，内容陈旧，内容相关性差。筛选偏离的描述、原因及对结果的影响：发表性 偏离，未与作者联系，定向分化成功结果可能被高估。文献筛选结果的输出形式：文献检索和筛选结果 的输出采用文献的引用形式，且保持了格式的一致 性，文献的引用形式包括作者、题名、期刊名称、发 表年代、卷数(期数)、页码等。经筛选纳入评价的文 献提供了全文。检索偏离的描述、原因及对结果的影响:检索词的 逻辑钿己不同，影响检索结果。2 结果 Results2

17、.1 牙髓干细胞的生物学性状牙髓干细胞来源于神 经崎，位于牙髓，属于成体干细胞，具有一定的自我 更新和定向分化能力。间充质干细胞的一些特异性 表面标记物可以在研究中被用于识别牙源性干细胞， 如常被用于识别硬组织的间充质干细胞基质细胞抗 原1(stromal cell antigen 1, STRO-1)B广泛应用 于牙髓干细胞的识别，显示为阳性；间充质干细胞主 要表面标记物CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、 CD117、CD146、CD166和CD271在牙髓干细胞中 呈阳性表达，其中CD105和CD117在牙髓干细胞上阳 性表达，提示它有良好的增殖分化能力叫 造血干细 胞主

18、要表面标记物CD45等呈阴性表达，CD34在不同 的研究中阳、阳性表达有争议的。国际细胞治疗协 会把CD105+/CD73+心D341CD45-作为间充质干细 胞的特征。Yasui等根据细胞表达2种表面标记物 LNGFR(CD271)和THY-1 (CD90)确定牙髓组织特异 的细胞群，纯化人牙髓干细胞，这些细胞同时表达已 知的间充质细胞标记物。分离的牙髓来源的 LNGFRLW+ TH Y-1血卜+细胞代表高纯度的克隆形成细 胞群，这些细胞表现出长期增殖、多向分化潜能，能 促进新骨形成。因此建议，LNGFRLW+THY-1H明牙 髓来源的细胞可为骨再生提供一种很好的细胞来源。 牙髓干细胞具有多

19、向分化潜能，可以在特定条件下分 化为骨、软骨、神经细胞、肌细胞、脂肪细胞和角膜 上皮等多种组织细胞，可用于牙本质再生、骨组织再 生、神经修复等研究领域何。在临床治疗中已有成 功被用于骨组织再生的报道H叱2.2 牙髓干细胞的分离与储存相比其他成体干细 胞，牙髓干细胞可以较容易的从正畸拔除的牙齿、脱 落的乳牙、拔除的阻生齿的牙髓中获取。但是，到目 前为止，大多数分离、扩增方法还不能完全令人满意, 因为这些方法有可能改变细胞的生物学特性和分化 细胞的质量m。Hilkens等口©研究发现，目前广泛应 用的牙髓组织酶消化法(the enzymatic digestion of the pulp

20、 tissue , DPSC-EZ)禾口夕卜植你去(the explant method , DPSCQG)分离的牙髓干细胞，均可较好 的应用于骨组织再生。Eubanks等网研究发现，用以 上两种分离方法从1个第三磨牙分离的细胞，经过2 周培养均能回收大约106个细胞。不断有研究认为， 酶消化法有可能影响细胞的表型和性能，故不适于治 疗用细胞分离M叫。相比而言，外植体法更容易、快 捷、安全、经济，更符合GMP指南获得临床级数量 的间充质干细胞，而且获得的牙髓干细胞显示相似或 更高的分化能力何。Murakami等四用粒细胞集落刺 激因子(granulocyte-colony stimulatin

21、g factor , GCSF)分离牙髓干细胞，并诱导其定向分化，然后移 植入免疫缺陷大鼠，结果显示其高效安全。目前用于 分离牙髓干细胞的粒细胞集落刺激因子已有商品化 试剂NEUTROGIN气牙髓可以储存在4 °C冷蹄境中过夜，在-85 到-196 °C冷冻环境中可以储存1周从冷藏或冷冻的 牙髓中分离牙髓干细胞除成功分离数量有所下降外， 其表面抗原仍有活性，免疫功能和分化能力上并无损 失1划。Mun6var等将分离出的牙髓干细胞(CD105+) 分别用Kamath法)：10%二甲基亚砚+体积分数为 70%胎牛血清+20% NH(non-hematopoietic)干细胞 培

22、养液；Papaccio法mi : 10%二甲基亚题+体积分数 为90%胎牛血清冻存。通过比较两种方法冻存30 d的 细胞,发现Papaccio)去(59.5%)匕匕Kamath)去(56.2%) 有更高的细胞生存率，而对于冻存1 d(65.5%)和7 d (56%)的细胞Kamath法更优。冻存后的人牙髓干细胞 表达间充质干细胞标记物，但冻存时间可能通过改变 细胞膜蛋白空间构型或者在某个分化水平抑制细胞， 从而影响表面标记物的表达函。因此，Ducret等国 推荐在分离和培养细胞时用人胎盘I型和m型胶原 等量混合预涂培养皿，因为这两种胶原是牙髓细胞外 基质中含量最丰富的胶原。用无异种分离试剂和确

23、定 的培养基(如SPE-IV®,含临床级人白蛋白，a-MEM , rhlGF-1 , rhFGF-2)取代通用产品培养和传代细胞。 经过上述方法分离培养的牙髓细胞在无血清培养基 中冻存后，不会影响细胞的倍增时间和收集细胞数 > ,细胞活力与新鲜细胞相比有所下降，但与文献报 道相似12” 一些发达国家如日本、美国和挪威先后建 立牙齿银行，为牙髓干细胞的基础和临床应用研究提 供便利，但牙齿银行用于临床储存维持费用较高，较 难为发展中国家接受，而最新的全牙储存方法可以在 保证牙髓干细胞免疫功能及分化能力不受影响的同 时降低储存成本12叱2.3 牙髓干细胞在再生医学中的应用牙髓干细胞具

24、 有多向分化、获取简便的特性，被广泛应用于各种退 行性疾病的再生医学治疗研究Q目前，牙髓干细胞 用于骨组织修复已经进入临床应用研究阶段，在神 经、心肌、肝细胞、血管修复等方面尚处于动物实验 研究阶段。牙髓干细胞在再生医学方面已经显示出巨 大潜能，有可能用于治疗各种人类疾病。2.3.1 应用牙髓干细胞修复牙髓和牙本质成人牙 髓干细胞亚组分CD317CD146- SP细胞CD105,细 胞，具有较高的血管和神经分化潜力，可以作为潜在 的临床牙髓修复材料网。日-Backly等将新西兰白 兔牙髓干细胞接种在聚乳酸乙醇酸支架上，然后移植 入兔皮下12 d ,观察到类似于牙本质小管的结构。 Suzuki等

25、画将人类牙髓干细胞接种在胶原支架上，然 后在体外加入骨形态发生蛋白7 ,观察到牙髓干细胞 的钙化。在牙髓干细胞胶原支架复合体中添加碱性成 纤维细胞生长因子，移植入大鼠背部,观察到牙髓样 细胞及血管的再生。研究发现在鼠齿根管治疗后，将 牙髓干细胞用于牙髓再生的效果更好。但目前尚无法 将牙髓干细胞培养为完整的牙髓-牙本质复合体。2.3.2 应用牙髓干细胞修复骨组织CDNA微阵列分 析表明，牙髓干细胞参与卢页面结构，包括颅面部骨骼 与软骨的形成的L牙髓干细胞向骨组织分化的能力在 较多实验中得到验证。在体外，牙髓干细胞表达成骨 标记物包括骨涎蛋白(bone sialoprotein , BSP)、碱性

26、 磷酸酶(alkaline phosphatase , ALP)、牙本质涎蛋白 (entin sialoprotein , DSP),可以分化为成骨细胞也 Graziano等1刈应用磁激活细胞分选法分选人牙髓干细 胞，被选出的CD34+干细胞能分化为前成骨细胞，不 需通过扩增，将其黏附于聚乳酸支架，移楂入免疫缺 陷大鼠，结果发现回收的骨结节类似于原始支架尺 寸，在免疫荧光?X射线下呈现骨组织的特征，且新 生成的血管具有人类血管特征。de Mendoca Costa 等8将人牙髓干细胞与胶原膜黏合，移植入全层颅骨 缺损的非免疫缺陷大鼠，观察到颅骨缺损的修复。聚 合酶链反应扩增发现新生成的骨细胞含

27、有人类DNA , 提示颅骨的修复源于牙髓干细胞。Tabatabaei等I321 通过正畸治疗中的机械力刺激人牙髓干细胞，与对照 组相比，成骨标记物碱性磷酸酬口骨桥蛋白含量显著 提高，结果提示不使用试剂，仅通过机械力可以诱导 牙髓干细胞向成骨方向分化。d'Aquino等【划分离提取 人第三磨牙内牙髓干细胞，扩增后黏附于胶原蛋白海 绵支架，填充于由于骨吸收造成的自体下颌骨的骨缺 损处，3个月后临床、X射线及组织学检测表明骨组织 完全再生，1年后再生骨组织功能达到最佳，提示人 牙髓干细胞可以完全恢复人类下颌骨缺损。2.3.3 应用牙髓干细胞修复神经组织Sakai等发 现，牙髓干细胞能诱发脊髓

28、损伤后的神经再生。将牙 髓干细胞移植到大鼠的脊髓横断处，可分化为成熟的 少突胶质细胞，通过促进轴突再生，抑制轴突生长抑 制因子，从而抑制神经元、星形胶质细胞、少突胶质 细胞的凋亡达到再生神经的目的。de Almeida等附 采用小鼠挤压神经损伤模型也支持上述结论。Apel 等m在阿尔茨海默病和帕金森病体外模型中将大鼠 牙髓干细胞加入至原代神经元培养，2 d后加入神经 毒素,发现牙髓干细胞可以减弱毒素的毒性，保护原 代神经元并释放骨形态发生蛋白2和神经营养因子 (包括神经生长因子、胶质细胞源性神经营养因子、 脑源性神经营养因子)。Chang等发现,在电刺激 下，含有牙髓干细胞的培养基中含有更多的

29、BID微管 蛋白、胶质纤维酸性蛋白和少突胶质细胞，提示牙髓 干细胞可以向成熟的多巴胺能神经元分化。 Matsubara等将人牙髓干细胞鞘内注射入脊髓急 性损伤大鼠，牙髓干细胞通过释放单核细胞趋化蛋白 1和唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素9，加速损伤修 复，使大鼠恢复行走能力。2.3.4 应用牙髓干细胞改善循环系统功能 Gandia 等6】采用心肌内注射法将牙髓干细胞注入心肌梗死 裸大鼠模型内，牙髓干细胞通过分泌多种促血管生成 与抗凋亡因子，包括血管内皮生长因子、胰岛素样生 长因子1和2、干细胞因子和粒细胞集落刺激因子，促 进生成新的血管和心肌细胞。实验组大鼠心前壁增 厚，梗死面积减小，心脏功能改

30、善并有新血管生成。 lohara等138将牙髓干细胞移植入后肢缺血小鼠模型， 通过表达促血管生成因子如血管内皮生长因子，促进 毛细血管的生成。2.3.5 牙髓干细胞在其他组织修复中的应用 研究 发现牙髓干细胞还具有分化为肌肉、角膜、肝细胞、 胰岛素生成细胞、皮肤等多种细胞与组织的能力。Yang等将人牙髓干细胞注射入骨骼肌缺损小鼠模 型中，发现有肌肉再生的现象。牙髓干细胞通过产生 抗肌萎缩蛋白(dystrophin),改善肌营养不良症状。 Gomes等阿使用兔眼角膜烧伤模型，将组织工程牙 髓干细胞片移植入切除烧伤部位的角膜床中，3个月 后角膜透明度有所改善，有少量新血管生成。 Ishkitiev

31、e等网在体外培养人牙髓干细胞,使用肝生 长因子刺激，培养出高纯度的肝细胞样细胞。此后， Ishkitieve等I421使用人牙髓干细胞治疗胆汁淤积型肝 硬化,使肝功能完全恢复，且与骨髓干细胞相比出现 恶曲中瘤的风险有大幅度降低。石建峰等网通过构建 重组转录因子hFOXA2和hPDXl慢病毒载体，转染人 牙髓干细胞成功诱导其形成胰岛素生成样细胞，提示 牙髓干细胞可用于1型糖尿病的治疗。Nishino等网 使用裸鼠全层皮肤缺损模型，将人牙髓干细胞移植入 伤口组织，结果皮肤组织加速愈合，缺损区域有人类 I型胶原的形成。3 结论 Conclusion综上所述，牙髓干细胞来源于牙髓，获取方法 简便，有相

32、对成熟的分离和储存方法。牙髓干细胞 具有自我更新与多向分化能力，在适当的条件下能 分化为骨组织、神经组织、肌组织、角膜、肝细胞、 胰岛素生成细胞等多种组织与细胞。牙髓干细胞在 骨组织修复领域已进入临床研究阶段，而向其他组 织分化的研究尚处于起步阶段或基础研究阶段，其调 控机制存在着诸多问题，有待进一步研究。由于牙髓 干细胞获得数量有限，在临床应用中受到限制，而且 干细胞应用于再生医学刚刚起步，远期疗效有待观 察，各国对此谨慎，在一定程度上阻滞了牙髓干细胞 临床应用研究的发展。未来研究有必要进一步确定更 特异的间充质干细胞标记物，并且随着研究的深入， 获得临床治疗级别的更高效、可再生、安全并且标

33、准 化的牙髓干细胞分离扩增方法岫倒，将使牙髓干细胞 在再生医学领域的潜能被进一步发掘。作者贡献:第一作者完成设计、收集资料、成文，通 讯作者审校，第一作者和通讯作者对文章负责。利益冲突:所有作者共同认可文章无相关利益冲突。伦理问题:没有与相关伦理道德冲突的内容。文章查重;文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测 系统进行3次查重。文章外审:文章经国内小同行外审专家双盲外审，符 合本刊发稿宗旨。作者声明:第一作者对研究和撰写的论文中出现的不 端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算 机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁， 可接受核查。文章版权:文章出版前杂志已与全体作者授

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