实验五 细菌染色法

1、實驗五 細菌染色法 Exp 8. Gram Stain一、目的：學習格蘭氏染色 (Gram stain) 的原理和方法，將細菌分為格蘭氏陽性 (gram positive)及格蘭氏陰性 (gram negative) 兩類。二、原理：q鑑別染色 (differential staining) 須使用三類染劑：a. 初染劑 (primary stain)：將所有細胞染上顏色。b. 脫色劑 (decolorizing agent)：因細胞壁構造的不同，將某些細胞上的初染劑除去。c. 複染劑 (counterstain)：將被脫色的細胞染上另一種顏色 (與初染劑的顏色不同)。q格蘭氏染色是最重要的鑑

2、別染色法 【參考課本p. 60-62】，其所使用的藥劑如下：a. 初染劑：結晶紫 (crystal violet)，將所有細胞染成紫色。b. 媒染劑 (mordant)：格蘭氏碘 (Gram iodine)，會和結晶紫形成錯合物crystal violet-iodine (CV-I) complex 而加深其顏色；在格蘭氏陽性細胞，更進一步與其細胞壁上的鎂核糖核酸 (magnesium-ribonucleic acid) 成分形成錯合物magnesium-ribonucleic acid-crystal violet-iodine (Mg-RNA-CV-I) complex，因而比 CV-I

3、更難從細胞上除去。c. 脫色劑：95乙醇，作為脂類溶劑及蛋白質脫水劑，對於格蘭氏陽性細胞，因其細胞壁上所含脂質較少，在被乙醇作用之後只能在壁上形成極小的孔，且立刻因蛋白質的脫水而關閉；在格蘭氏陰性細胞，其壁上含大量脂質，被乙醇溶解形成大孔，即使引起蛋白質脫水也無法關閉，CV-I 錯合物便輕易被釋出，使其變成無色的細胞。d. counterstain：番紅 (safranin)，將被脫色的細胞染上紅色，而格蘭氏陽性細胞仍為紫色。q為製作好的染色抹片 (smear)，須留意以下數點：1. 最重要的是脫色步驟，其根據於 CV-I complex 容易被細胞釋放。若過度脫色，將使格蘭氏陽性細胞也呈現陰

4、性反應 (所有初染劑皆被除去)；而脫色不足，則可能使陰性細胞呈陽性反應 (CV-I complex未完全移除)。2. 在施用各藥劑之間，必須以水沖洗，以除去多餘的藥劑，並適於下一藥劑的施用。3. 最佳的格蘭氏染色標本，必須使用新鮮的培養物 (不超過 24 hr)，尤其是格蘭氏陽性的細胞，若培養太久，可能使其失去保有初染劑的能力，而呈現格蘭氏變異性 (gram-variable)，即部分細胞為紫色，而其他為紅色。三、器材1. culture：(每組)(1) Escherichia coli(2) Staphylococcus aureus(3) Bacillus cereus Mix (1) +

5、 (3) 學生自行在載玻片上 Mix【依時間而決定要否】2. equipment：蓋玻片及載玻片、染色盆、木夾、酒精燈、無菌接種器材、麥克筆、鑷子、顯微鏡、鏡油、吸水紙、洗瓶、染劑、廢染劑收集桶G染色前注意事項：1. 玻片若髒，先以紙巾沾 95% 藥用酒精 (無色) 擦拭，再沾 95% 藥用酒精於酒精燈上燒，冷卻待用。若還不乾淨先用清潔劑洗淨，再重覆前述。2. 玻片上須先行標示操做面 (邊角處)，以免沖洗後不知菌體在何面。3. 染色抹片的處理：a. 若實驗菌株為固態培養基，如 slant：先用洗瓶滴1小滴水 (愈小愈可節省風乾時間) 於載玻片上勾菌塗開 (勿太多) 完全風乾 (務必要完全風乾，

6、勿在火上烤) 酒精燈上熱固定約 2 秒 (太久細胞會破掉) 染色 擦手紙吸乾水份 乾燥 油鏡鏡檢。b. 若實驗菌株為液態培養基，如 broth：先將 broth 搖勻勾取 1 loop 菌量於載玻片上 完全風乾 熱固定 染色 吸乾水份 乾燥 油鏡鏡檢。4. 洗瓶內的水用完請自行裝自來水。5. 染色失敗的載玻片可洗淨後重覆使用，務必沖洗完全。6. 可先將Exp 8-10的染片前處理先做好，以節省時間。7. 做好Exp 8-10的染片，繳交前皆須經過助教確認通過後才算完成。 每人染色成功的玻片，經助教確認後，請標上班別、組別、操作者姓名、菌名縮寫、染色項目及屬於正或負，以組為單位同置於講桌上。四、

7、實驗步驟1. 將做好前處理的抹片，放置於染色盆架上。2. 滴加 crystal violet 於所有分佈玻片上的菌株後，開始計時 1 分鐘。3. 用洗瓶洗掉染劑。4. 滴加 Gram's iodine ，計時 1 分鐘。5. 用洗瓶洗掉染劑。6. 滴 95% Ethanol，直到澄清。 (為調控點，約30秒左右；須自行拿捏)7. 用洗瓶洗掉染劑。8. 染 safranin ，計時 45 秒。9. 用洗瓶洗掉染劑。10. 用吸水紙 (擦手紙) 吸乾抹片周圍，以及輕壓染面吸走表面水分。11. 顯微鏡觀察，先以高倍鏡檢查染色成功與否。12. 不成功則洗淨、重來。若染色成功則改以油鏡觀察並繪圖

8、。 提示：(1) E. coli Gram (-)；桃紅色，短桿菌。(2) S. aureus Gram (+)；藍紫色，葡萄狀球菌。(3) B. cereus Gram (+)；藍紫色，長桿菌。 注意事項：1. 一般油鏡觀察可不加蓋蓋玻片。2. 每種染劑使用完後，滴頭決不可亂放於非原來的染劑瓶中，違者平時成績以零分計。 Exp 9. Acid-Fast Stain一、目的：了解抗酸性染色原理及操作，將細菌分為抗酸性 (acid-fast) 和非抗酸性 (non-acid-fast) 兩類【參考課本p. 65 】。二、原理：分枝桿菌屬 (Mycobacterium) 的菌體只能以抗酸性染色才可

9、被觀察，而 M. tuberculosis (結核桿菌) 和M. leprae (麻瘋桿菌) 為人類的病原菌，因此抗酸性染色法有診斷上的價值。分枝桿菌 (mycobacteria) 與其他微生物的最大不同，在於其有著厚的蠟壁 waxy (lipoidal) wall，使得染料難以滲入其中；而一旦染上，則即使以酸醇 (acid alcohol) 也無法除去，故稱其為抗酸性，反之其他微生物可輕易以酸醇脫色，稱為非抗酸性。q抗酸性染色使用以下藥劑：a. 初染劑：碳酸複紅 (carbol fuchsin)，一種酚染劑 (phenolic stain)，可溶於mycobacteria胞壁中的脂類物質中。

10、染色時加熱以加強其穿透效果，使之進入細胞質中；或以一種溼劑 (wetting agent) (Turgitol) 加入染料中，可減少細胞壁與染劑間之表面張力，達到與加熱同樣的效果。染過後細胞呈現紅色。b. 脫色劑：酸醇 (3HCl + 95Ethanol)，在脫色之前須先冷卻抹片，這可使蠟質細胞物質變硬。因為初染劑在 mycobacteria 細胞壁蠟質中的溶解度比在脫色劑中大，故細胞可保持紅色；但對於非抗酸性的細胞，初染劑在脫色劑中輕易就被洗去。c. 複染劑：亞甲基藍 (methylene blue)，用以將被脫色的 (即非抗酸性) 細胞染上藍色。三、器材1. culture：(每組)(1)

11、 72 hr Mycobacterium smegmatis【型態類似短桿】(2) 24 hr S. aureus Mix (1) + (2) 學生自行在載玻片上 MixAcid Fast Stain TB：Primary：Bacto TB Carbol fuchsin (4 min)Decolorizing agent：Bacto TB DecolorizerCounterstain：Bacto TB Brilliant Green K (30 sec)成分如下：Bacto TB Stain Set K （Ingredients per liter） Bacto TB Carbolfuchs

12、in KFBasic Fuchsin 15 gPhenol USP 45 gIsopropanol 200 mlEthanol 50 mlDistilled Water 750 ml Bacto TB DecolorizerHydrochloric acid 30 mlDenatured Ethanol 970 ml Bacto TB Brilliant Green kBrilliant Green 2 gSodium Hydroxide 0.02 gDistilled Water 1000 ml 2. equipment：蓋玻片及載玻片、染色盆、木夾、酒精燈、無菌接種器材、麥克筆、鑷子、顯微

13、鏡、鏡油、吸水紙、洗瓶、染劑、廢染劑收集桶四、實驗步驟1. 將做好前處理抹片，放置於染色盆架上。2. 取標示為 “Primary” 的染劑滴加，同時於酒精燈上加熱，計時 4 分鐘。注意：須小心加熱，隨時補充蒸發的染劑。勿讓染劑在玻片上沸騰。3. 用洗瓶洗掉染劑。4. 滴洗 “Decolorizer”，直至澄清。5. 用洗瓶洗掉染劑。6. 染複染劑 ，計時 30 秒。7. 用洗瓶洗掉染劑。8. 用吸水紙 (擦手紙) 吸乾抹片周圍，以及輕壓染面吸走表面水分。9. 顯微鏡觀察，先以高倍鏡檢查染色成功與否。10. 不成功則洗淨、重來。若染色成功則改以油鏡觀察並繪圖。 提示：(1) 72 hr Myco

14、bacterium smegmatis【型態類似短桿】A()；紅色。(2) 24hr S. aureus A()；綠色。 Exp 10. Spore Stain一、目的：了解孢子染色的原理及操作，分辨細菌孢子和營養細胞 (vegetative cell) 的形態差別 【參考課本p. 63】。二、原理：厭氣性的梭狀芽胞桿菌屬 (Clostridium)、脫硫腸狀菌屬 (Desulfo-tomaculum) 及需氣性的桿菌屬 (Bacillus) 在環境不適宜營養細胞生活時，可形成內孢子 (endospore)，在環境變得更糟時便將之釋出即為孢子 (spore)，孢子為休眠狀態，可抗熱、凍、輻射、

15、乾燥及化學藥劑等，待環境適宜時，孢子可萌發 (germination) 而成為營養細胞。q孢子染色使用以下藥劑：a. 初染劑：孔雀石綠 (malachite green)，因為孢子的不透水性外殼 (coat) 染色不易，故須加熱以增強穿透力。染過後孢子及營養細胞皆呈綠色。b. 脫色劑：自來水；孢子一旦被染上色，便不會被水脫色，而在營養細胞上的染劑則會被沖去，而呈無色狀態。c. 複染劑：番紅 (safranin)，用以將被脫色的營養細胞染上紅色，而孢子仍是綠色。三、器材1. culture：(每組)72 hr B. cereus (NA slant ) (每人)2. equipment：蓋玻片及載玻片、染色盆、木夾、酒精燈、無菌接種器材、麥克筆、鑷子、顯微鏡、鏡油、吸水紙、洗瓶、染劑、廢染劑收集桶四、實驗步驟1. 將做好前處理的片子，放置於染色盆架上。2. 滴加 malac