大黄素、黄芪多糖在体外对乙型肝炎病毒的抑制作用

1、大黄素、黄芪多糖在体外对乙型肝炎病毒的抑制作用 08-01-15 11:18:00 编辑：studa20 作者：党双锁张正国张欣宋平边静程延安 【摘要】【关键词】 大黄素；黄芪多糖；乙型肝炎病毒；细胞培养Inhibition on hepatitis B virus by emodinand astragalus polysaccharides in vitrotime PC and concentrationn vitro (P0.05). The interaction was not significant between emodin and APS (P0.05). Conclusi

2、on Emodin had time and concentrationdependent inhibitory effects to HBV in vitro in some extent; APS could not inhibit HBV obviously in vitro; Coadministration of emodin and APS had not significant interaction in restraining HBV in vitro.KEY WORDS: emodin; astragalus polysaccharides; hepatitis B vir

3、us; cell culture1 材料与方法1.1 药物 大黄素(纯度950g/L购自西安崇信天然添加剂有限公司，由国家中药鉴定所鉴定，批文号：25100806)，黄芪多糖(纯度为600g/L，西安鸿生生物技术有限公司生产，国家中药鉴定所鉴定，批号：040618)，干扰素(购自罗氏公司，批号：010801I)，拉米夫定(3TC)0.1mmol/L的母液，由西安交通大学药学院提供。1.2 试剂及主要仪器 噻唑蓝(MTT，Sigma)，二甲基亚砜(DMSO, Sigma)，HBsAg和HBeAg的ELESA检测试剂盒(上海华泰生物工程公司)，HBV DNA提取及扩增荧光检测试剂盒(广州中山大学达

4、安基因股份有限公司)，和PE7700型自动荧光PCR仪(美国Perkin Elmer公司)。1.4 细胞培养 2.5g/L胰蛋白酶消化细胞，以1104个/孔接种于96孔板，每孔200L，于37、50mL/L CO2培养箱培养24h，待细胞贴壁后，换培养液进行实验。1.5 实验分组 实验共分3大组，17个剂量组，分组如下：阳性对照组分别为干扰素(INF)、拉米夫定，各设3个剂量组(125000、250000、500000u/L INF ；0.025、0.05、0.1mol/L 3TC)；实验组为3个组，即大黄素组(12.5、25.0、50.0mg/L)，黄芪多糖组(120、240、480g/L)

5、，联合用药组(25.0mg/L大黄素120g/L黄芪多糖，50.0mg/L大黄素120g/L黄芪多糖，25.0mg/L大黄素240g/L黄芪多糖，50.0mg/L大黄素240g/L黄芪多糖)；阴性对照组即生理盐水组，用等体积生理盐水加入。实验中除阴性对照组设10个复孔外，其余每个剂量组设5个复孔，用含药物培养液进行干预培养。每3d换同样浓度含药培养液及对照培养液1次。各孔在3、6、9d时，将吸去的上清液置于-20冰箱保存待检。1.6 MTT实验 加药第9天吸去上清，每孔加5g/L的MTT 20L，37培养4h，弃上清后，每孔加入150L DMSO，震荡10min，测定570nm吸光度。按下列公

6、式计算细胞的抑制百分率。细胞抑制百分率=阴性对照组平均A值-实验组平均A值阴性对照组平均A值100%按下列公式计算药物的半数细胞毒性浓度(CC50)。CC50= lg-1B+0.5-50%抑制百分率-50%抑制百分率C (B=lg50%药物浓度，C=lg2)1.7 荧光定量PCR法检测细胞外HBV DNA1 按照达安基因股份有限公司HBV核酸提取与核酸扩增荧光检测试剂盒说明书操作。两引物序列分别为P15ATCCTGCTGCTATGCCTCATCTT3，P25ACAGTGGGGGAAAGCCCTACGAA3，荧光探针序列为5TGGCTAGTTTACTAGTGCCATTTG3。各反应管放入PE77

7、00自动荧光PCR仪，按下列条件扩增：93 2min预变性，然后93 45s到55 1min循环扩增10个循环，再按93 30s到55 45s循环扩增，共30个循环。反应结束后由计算机自动分析出HBV DNA定量结果。按照下面公式计算药物对HBV DNA的抑制率。 HBV DNA抑制率=阴性对照组HBV DNA拷贝数-实验组HBV DNA拷贝数阴性对照组HBV DNA拷贝数100% 按下列公式计算药物的半数抑制浓度(IC50)。 IC50=lg-1B+0.5-50%抑制百分率-50%抑制百分率C (B= lg 50%药物浓度，C=lg 稀释倍数的倒数) 治疗指数(TI)= CC50/IC50。1.8 HBsAg和HBeAg的测定 使用双抗体加心ELESA法1。根据试剂盒说明测定培养上清液的HBsAg和HBeAg，记录P/N值，按照下面公式计算药物对HBV DNA的抑制率。HBsAg(HBeAg)抑制率=对照组P/N值-药物组P/N值对