天然药物化学第五章

1、第五章第五章 薄层色谱法和薄层色谱法和高效液相色谱高效液相色谱法法 教学目标教学目标n1、掌握薄层色谱法和高效液相色谱法。薄层色谱法和高效液相色谱法。n2、掌握薄层色谱法和高效液相色谱法在天然药物化、掌握薄层色谱法和高效液相色谱法在天然药物化学中的应用。学中的应用。n3、掌握中药有效成分结构鉴定方法。、掌握中药有效成分结构鉴定方法。第一节薄层色谱法第一节薄层色谱法一、定义：一、定义： 是把固定相均匀地涂在一块玻璃板或塑料板上，形成是把固定相均匀地涂在一块玻璃板或塑料板上，形成一定厚度的薄层并使其具有一定的活性，在此薄层上一定厚度的薄层并使其具有一定的活性，在此薄层上进行色谱分离，这种方法称为进

2、行色谱分离，这种方法称为薄层色谱。薄层色谱。二、特点二、特点n 简单，易行，价格低廉简单，易行，价格低廉n 分析快速分析快速n 在色谱板上检测样品，不会丢失组分在色谱板上检测样品，不会丢失组分n 可用多种显色剂可用多种显色剂n 可在同一块板上同时分离多个样品可在同一块板上同时分离多个样品n 所需样品量少所需样品量少n 灵敏度高灵敏度高三、基本原理三、基本原理利用作为固定相的吸附剂对混合物中各种成分吸附能力的大小的不利用作为固定相的吸附剂对混合物中各种成分吸附能力的大小的不同，使各成分得到相互分离。同，使各成分得到相互分离。四、固定相（吸附剂）四、固定相（吸附剂） 硅胶硅胶H H（不含粘合剂）（

3、不含粘合剂） 硅胶硅胶Q Q（含有（含有15153535石膏作为粘合剂）石膏作为粘合剂） HF HF254254（含在（含在254nm254nm波长紫外光下显荧光的无机荧光剂）波长紫外光下显荧光的无机荧光剂） HF HF254+365nm254+365nm五、制备与分析五、制备与分析n 铺层铺层n 点样点样n 展开展开n 显色显色n对于样品的酸碱性，如果试样与吸附剂一为酸性一为碱性，则有可能会发生酸碱反应而产生不可逆吸附，使分离过程难以进行。故吸附剂与的酸碱性应与试样保持一致。硅胶稍带酸性，氧化铝稍带碱性，可以将二者：混合制成中性的吸附剂，或用稀碱液制备薄层使硅胶薄层成碱性，或用稀酸液制备薄层

4、使氧化铝薄层成酸性或在展开剂加酸碱来调其酸碱性溶剂、吸附剂的选择规律n记住一个图六、应用六、应用 1、有机合成、有机合成1: 硝基苯标准样品硝基苯标准样品2: 反应前混合液反应前混合液3: 反应液反应液4: 苯胺标准样品苯胺标准样品 可在可在254nm下进行下进行A：反应开始前：反应开始前B：反应：反应10minC：反应：反应20minD：反应：反应30min31 214441133ABCD2、控制中药制剂的质量、控制中药制剂的质量 选择与确定对照品选择与确定对照品 制备供试液制备供试液 对色谱分离条件进行优选对色谱分离条件进行优选举例说明举例说明甲康宁颗粒中五味子醇甲的薄层色谱图甲康宁颗粒中

5、五味子醇甲的薄层色谱图1:对照品对照品 2:药材药材 3:制剂制剂 4:阴性对照阴性对照12 3 4第二节第二节 高效液相色谱法高效液相色谱法 高压液相、高速液相色谱法（特点：高压液相、高速液相色谱法（特点：高高 压、高速、高灵敏度）压、高速、高灵敏度） 为了解决固定液的流失，研制了化学为了解决固定液的流失，研制了化学键合固定相键合固定相 将十八烷基将十八烷基C18H37 高压泵高压泵 进样器和色谱柱进样器和色谱柱 检测器检测器贮液器贮液器高压泵高压泵进样器进样器色谱柱色谱柱馏分收集器馏分收集器检测器检测器记录仪记录仪制备：制备：尽可能多的获得样品纯组分尽可能多的获得样品纯组分 分析型色谱柱：

6、（内径分析型色谱柱：（内径45mm，长，长2550cm）半制备：半制备：（内径（内径910mm，长，长2550cm）制备柱制备柱: （内径（内径2022mm，长，长25cm）制备柱上样量分析柱上样量制备柱上样量分析柱上样量dc2:制备柱内径制备柱内径 L2：制备柱长：制备柱长dc1:分析柱内径分析柱内径 L1：分析柱长：分析柱长121222LdLdcc流量的放大比：流量的放大比：制备柱流量分析柱流量制备柱流量分析柱流量2122ccdd塔板数：塔板数： 2212)(54. 5)(16YtwtnRbR21YtR: 保留时间保留时间wb：峰宽峰宽 半峰宽：峰高一半时的宽度半峰宽：峰高一半时的宽度分离

7、度分离度w: 为峰宽为峰宽R1.5 两峰完全分离两峰完全分离2112)(2wwttRR第三节第三节 天然药物化学成分天然药物化学成分结构测定的一般步骤：结构测定的一般步骤：一、测定程序一、测定程序n纯度纯度(可以用薄层，但必须是三种不同的展开系统来证明可以用薄层，但必须是三种不同的展开系统来证明）n分子式的测定（分子式的测定（元素分析、高分辨质谱元素分析、高分辨质谱）n化合物功能基和分子骨架的推定（化合物功能基和分子骨架的推定（紫外光谱紫外光谱UI、红外光谱红外光谱IR、质谱质谱MS、核磁共振谱核磁共振谱NMR）n化合物结构式的确定化合物结构式的确定（还可测定试样的旋光谱以确定化合物的（还可测

8、定试样的旋光谱以确定化合物的立体化学结构，采用立体化学结构，采用X射线研究化合物的精细结构，如键长、射线研究化合物的精细结构，如键长、键角、和绝对构型）键角、和绝对构型）二、测定方法二、测定方法n确定分子式并计算不饱和度确定分子式并计算不饱和度n公式：公式：u=u=-/2+/2+1(-/2+/2+1(u u表示分子的不饱和度；表示分子的不饱和度；表示一价原子的数目；表示一价原子的数目；表示三价原子的数目；表示三价原子的数目； 表示四价原子的数目）表示四价原子的数目）n例如分子式例如分子式C C3030H H4848O O3 3，则该化合物的不饱和度为，则该化合物的不饱和度为3030。n质谱质谱

9、n2、紫外、紫外可见光谱可见光谱n是利用不同的波长（常在是利用不同的波长（常在200700nm)的紫外及可见光的紫外及可见光为光源，依次照射一定浓度的试样溶液，化合物分子为光源，依次照射一定浓度的试样溶液，化合物分子因吸收紫外及可见光而产生电子跃迁，在不同的波长因吸收紫外及可见光而产生电子跃迁，在不同的波长处测量物质的吸收度，按吸收强度和吸收波长作图所处测量物质的吸收度，按吸收强度和吸收波长作图所得的吸收光谱。得的吸收光谱。n主要提供分子中有无共轭系统及共轭系统的长短；有主要提供分子中有无共轭系统及共轭系统的长短；有无醛、酮、酸、酯）。不是整个分子的特征。无醛、酮、酸、酯）。不是整个分子的特征

10、。n3、红外光谱、红外光谱n通常是采用通常是采用2.515m(4000m(4000667cm667cm-1-1) )范围内不同波长范围内不同波长的光波为光源，依次照射试样，化合物分子中化学键的光波为光源，依次照射试样，化合物分子中化学键的振动与转动，将在此区域内引起吸收，记录试样的的振动与转动，将在此区域内引起吸收，记录试样的吸收曲线所的吸收光谱。吸收曲线所的吸收光谱。n提供的信息主要是分子中具有哪些特定的官能团。对提供的信息主要是分子中具有哪些特定的官能团。对于已知化合物可与标准图谱对照，以特征区、指纹区于已知化合物可与标准图谱对照，以特征区、指纹区与标准图谱对照。与标准图谱对照。n特征区（

11、特征区（ 40001250cm-1)，对官能团的定性具有决定，对官能团的定性具有决定性的意义。性的意义。nO-H、N-H伸缩振动区（伸缩振动区（ 37503000cm-1)；C-H伸缩伸缩振动区（振动区（ 33002700cm-1)；三键对称伸缩区是；三键对称伸缩区是（ 24002100cm-1)；羰基的伸缩振动区是；羰基的伸缩振动区是（ 19001650cm-1)；双键的对称伸缩振动区是；双键的对称伸缩振动区是（ 16901600cm-1)；C-H弯曲振动区（弯曲振动区（ 1000650cm-1)。n指纹区主要是由原子或原子团间的键角变化所引起。此区间的吸收谱线细密、重叠复杂、且大多吸收强度

12、较小，谱带特征性差，难以解析，但分子结构的细微变化均能在此区域明显的反应出来，使每一化合物均有各自不同的吸收曲线，如同指纹。n4、质谱n化合物分子经电子流冲击或其它手段打掉一个电子后，形成正电荷离子，然后裂解成一系列的碎片离子，这些阳离子在电场和磁场综合作用下，按照离子质量大小依次排列而成的图谱。nM-eM+n横坐标是荷质比，纵坐标是相对丰度。n相对丰度：以强度最大的峰（称为标准峰或基峰）为100，其余的峰按与标准峰的比例加以表示，此种表示方法最为常用。n常见的碎片离子m/z值 离子 可能的结构类型29 CHO、C2H5 醛基、乙基30 CH2NH2 伯胺43 CH3CO、C3H7 乙酰基、丙

13、基45 COOH、CH3CH2O 羧基、乙氧基29、43、57、71 CH2H5、C3H7等 直链烃类39、50、51、52、65、77等 芳香化合物的开裂产物 芳香化合物60 CH3COOH 羧酸类、醋酸酯91 C6H5CH2 苄基105 C6H5CO 苯甲酰n5、核磁共振谱（Nuclear Magnetic Resonance)n是在一定强度的磁场作用下，以一定的频率的无线电波照射分子，引起分子中具有磁矩的原子核（如1H、13C）的能级跃迁，产生强弱不同的信号，记录吸收信号的强度，对应其吸收频率所得的波谱。n天然化合物中主要含有C、H原子，所以天然化合物化学成分结构的测定常应用氢核磁共振谱

14、（1H-NMR）和碳核磁共振谱（1C-NMR）。n氢核磁共振谱（1H-NMR）能够提供分子中不同种类氢原子的相关信息如氢原子的化学环境、不同化学环境下的氢原子的数目及其相邻基团结构等。n碳核磁共振谱（1C-NMR）化学位移范围较氢谱广，分辨率高，所以能提供更多有关分子骨架结构的信息。n（1）、化学位移n化合物分子中的氢核，由于所处化学环境的不同，会在不同的射频频率处产生共振，在谱图中显示出吸收峰位置的移动，这种因化学环境变化而引起的共振谱线位移的现象称为化学位移。n其绝对值较难测定，以相对值表示，符号是，国际统一单位是ppm。n不同的化学结构常在不同的特定区域内出现核磁共振谱峰，如下表所示一些

15、不同类型氢核化学位移的大致范围。化学位移与化学结构的关系质子 分子类型 值范围 C-H 脂肪族 0.05.0CC H 炔 1.83.0CCH 烯 4.57.5芳香质子 苯环或芳环 6.09.5O CH 醛 9.010.0OH 醇 0.5 5.5 酚 4.8 8.0 酸类 10.0 13.0NH 脂肪胺 0.32.2 芳香胺 2.65.0 酰胺 5.08.5n(2)、偶合常数：磁性核之间的相互作用-自旋偶合会引起核磁共振峰出现裂分现象，表现出不同的多重峰如二重峰、三重峰、四重峰、多重峰等。n裂分的重峰中小峰间的距离为偶合常数，单位是HZ。n对于1H而言，磁不等同的相邻氢是产生自旋偶合的基本条件。

16、n各等价基团内的1H核间没有相互作用，不产生自旋裂分，如甲基-CH3中的三个1H核无裂分现象。n裂分后的小峰数符合n+1规律（n为邻近C上干扰氢原子的数目）。n裂分峰的小峰强度之比以二项示（X+1）n展开后各项前的系数表示。n（3）、峰面积：在氢核磁共振谱中，峰面积以积分曲线高度表示，氢的数目与其面积积分值基本成正比。n举例乙苯的核磁共振谱。思考题n1、什么叫质谱？n2、什么叫氢谱？n3、什么叫制备型高效液相色谱？n4、简述薄层层析法、高效液相色谱法在中药化学中的应用。n5、什么叫Rf值？比较以下几个化合物在硅胶吸附色谱上Rf值的大小，并说明为什么？OHACHOBCOOHCn6、简述高效液相色谱分离法的工作原理？什么叫分